1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
水稻稻曲病（ricefalsesmut）又称为黑穗病、绿黑穗病、谷花病、青粉病等，俗称丰产果，是由稻曲病菌（Ustilaginoideavirens）[1]侵染引发的水稻穗部病害，是世界性水稻病害之一。该病害自19世纪80年代在印度首次发现以来，一直被认为是一种水稻次生病害[2]。但在20世纪80年代以后，水稻稻曲病在中国的发生频率增高，危害日益严重，由过去水稻的次生性病害逐步发展成为目前水稻生产上仅次于水稻稻瘟病、纹枯病之后的又一大真菌性病害[3]，在一些水稻产区甚至已上升为主要病害。由于稻曲病的发生不仅造成水稻减产，且会使稻米品质下降[4]，因此现已引起各国植物保护学者的高度重视，并开展了一系列深入细致地研究工作。然而目前对稻曲病的研究，多侧重于稻曲病菌的生物学特性、防治、毒素及侵染等方面，在稻曲病菌致病相关基因的研究方面尚不深入。
利用正反向遗传方法[5]对突变体进行分析是研究基因功能的两种有效途径[6]。正向遗传方法是指从突变的表型出发克隆到发生了突变的基因,确定该基因的功能。通过生物个体或细胞的基因组的自发突变或人工诱变，寻找相关的表型或性状改变，然后从这些特定性状变化的个体或细胞中找到对应的突变基因，并揭示其功能。反向遗传则是从突变的基因序列出发,鉴定该基因突变产生的突变体,最终确定该基因的功能[7]。通过基因的表达并显示出其表型，为基因序列与其生物学功能之间提供了直接的因果关系。自20世纪70年代起，真菌基因突变[8]出现了利用化学和物理方法诱导的人工突变，具有突变效率高的特点，但是产生的多位点突变往往导致基因的表型不易鉴定[9]。随后出现的插入突变法是获得突变体表型的主要方法。该方法从分子水平鉴定与表型相关的基因，从而揭示其致病基因功能的关键。农杆菌介导的遗传转化（Agrobacteriumtumefaciens-mediatedtransformation，ATMT)[10]是一种天然的植物遗传转化系统,外源基因在转基因植物中的拷贝数低、遗传稳定，已成为研究真菌基因功能的有效工具之一。通过ATMT方法将T-DNA随机插入至植物基因组，构建突变体库[11]，并根据突变体的表型筛选获得相关功能基因，已成功运用于多种植物功能基因研究[12]。在真菌中，农杆菌介导转化技术[13]首先在酿酒酵母中获得成功[14]，多种真菌也建立了根癌农杆菌介导的遗传转化体系。我国运用该技术也进行了大量相关研究，成功实现了稻瘟病菌及黄瓜炭疽菌等的遗传转化，为致病和生物学特性相关基因的分离和克隆奠定了基础。这些研究为丝状真菌的转化提供了技术支持，拓宽了转化技术的应用领域，同时为人们从分子水平阐释丝状真菌的遗传背景、互作模式及进一步的菌株改造提供有力条件[15]。
本实验室前期已利用ATMT技术构建了稻曲病菌的T-DNA随机插入突变体库。本课题旨在通过田间试验检测部分突变菌株在水稻上的致病性，并通过TAIL-PCR和Southern杂交试验对致病性改变的突变体中T-DNA插入位点进行分析，并克隆致病性丧失突变体的突变位点寻找稻曲病菌致病相关基因。
2. 研究的基本内容和问题
研究目标：
克隆2-3个稻曲病菌致病相关基因。
研究内容：
3. 研究的方法与方案
研究方法
（1）稻曲病菌培养和接种液配制；
（2）致病性检测：通过注射接种的方法检测稻曲病菌致病性。在水稻抽穗破口前6-8天接种，用注射器将接种液从侧面注入穗苞，每穗接种1mL。每个菌株接种3穗。水稻熟蜡期调查稻曲病的发病情况，统计稻曲球个数；
（3）TAIL-PCR实验：方法参照试剂盒说明书；
4. 研究创新点
本项目的特色或创新之处
（1）运用农杆菌介导转化法（ATMT）获得T-DNA插入突变体菌株。
（2）本项目属分子生物学、生理学和植物病理学等领域的交叉点研究，有利于参与成员对植保知识的运用与理解。
5. 研究计划与进展
研究计划及预期进展
2014.8~2014.9
完成稻曲病菌突变体库中菌株的活化和摇培；
