1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
内含子是真核生物基因在形成成熟RNA过程中由蛋白质-RNA复合体识别并剪切掉的非编码基因组序列。内含子广泛存在于真核生物基因组中，是真核生物基因组中重要的组成部分。一般而言，内含区域承受的选择压要大大低于外显子区域，因此内含子变异程度要高于编码序列。
自1980年提出分子标记概念以来，已开发的分子标记种类至少有十多种，目前常用的有:RFLP、RAPD、AFLP、SSR、SNP等［1～6］。尽管针对不同情况，不同标记各有所长，但总体而言，功能性、多态性、通用性以及特异性是衡量标记实用性的标准，也是开发时考虑的重点。EPIC（exon-primedintron-crossing）标记是一种基于内含子的分子标记，即在内含子序列两侧相邻的外显子区域设计引物，扩增整个内含子区域[7,8,9]，也称CATS（comparativeanchortaggedsequences）标记[10]。内含子多态性主要体现在内含子长度多态性（intronlengthpolymorphisms，ILPs）[11]、SNPs和插入与缺失（InDels）等。由于内含子是基因内的非编码序列，所承受的选择压低于外显子区域，其变异程度高于编码区域。Feltus等比较了8个水稻品种，发现在每1000个碱基中，内含子上SNP个数是外显子上的3倍［12］，因此内含子标记在多态性上会具有明显优势。同时内含子位于基因内部，利用其开发的标记具有功能性，可用于分子辅助育种。Wang等开发了水稻全基因组内含子标记，经PCR试验验证，80.47%的标记可在2个水稻自交系(Nipponbare和93-11)中获得清晰稳定的带型，在10个水稻中的PIC(多态性信息含量)平均值为0.451［13］；Liu等则在2012年开发了玉米抗病类似物序列的内含子标记，经在4个玉米自交系(Mo17、B73、丹340、黄早四)中验证，发现92.8%的标记可以扩增出清晰稳定的带型，PIC平均值为0.48［14］。以上结果也证明了内含子标记的实用性。
随着全基因组测序技术的迅速发展，棉花D染色体棉种（雷蒙德氏棉，Gossypiumraimondii）的全基因组测序已经完成，为开发棉花内含子标记提供了契机。目前，在动植物中已有一些EPIC标记开发的研究报告，但是有关棉花内含子标记的开发还未有研究涉及，本次课题研究旨在对棉花内含子标记作初步探索，设计内含子引物并调查这些引物在阿非利加棉及雷蒙德氏棉之间的多态性，进一步利用多态引物，对半野生棉种开展内含子在不同半野生棉种间的进化研究；对自然群体完成标记与耐逆性状的关联分析。同时，为今后系统发育分析、遗传学分析和图谱构建提供可选择的标记。
2. 研究的基本内容和问题
（1）研究目标
1）.完成全基因组EPIC标记的开发；
2）.鉴定部分标记在阿非利加棉及雷蒙德氏棉之间的多态性；
3. 研究的方法与方案
（1）研究方法
利用生物信息学方法对阿非利加棉和雷蒙德氏棉基因组序列，进行了棉种间全基因组内含子标记的开发，并对heatshockprotein，leucine-richrepeat，MAP，NAC，P450，WD40，WRKY及zincfinger类共计529对标记完成引物的合成。
通过PAGE胶检测，调查这些引物在阿非利加棉及雷蒙德氏棉之间的多态性。进一步利用多态引物，对半野生棉种开展内含子在不同半野生棉种间的进化研究；对自然群体完成标记与耐逆性状的关联分析。
4. 研究创新点
EPIC标记还具有特异性、共显性、中性和可靠性等特点。开发EPIC标记时，选择在单拷贝保守的外显子上设计引物，保证直系同源基因的扩增。目前，在动植物中已有一些EPIC标记开发的研究报告，如膜翅目小蜂、蕨类植物以及菲律宾蛤仔和文蛤等。但在棉花中还未见相关报道。本研究比较了雷蒙德氏棉与阿非利加棉中所有有内含子基因的内含子的差异，全基因水平上开发EPIC标记，并对开发的标记进行检测及应用。本项目的实施及顺利完成将为今后系统发育分析、遗传学分析和图谱构建提供可选择的标记。
5. 研究计划与进展
现已完成全基因组EPIC标记的开发，相关引物的合成，模板DNA的提取等工作。
预计
2014.01-2014.03：完成引物在阿非利加棉及雷蒙德氏棉之间的多态性鉴定。进一步利用多态引物，对半野生棉种开展内含子在不同半野生棉种间的进化研究；对自然群体完成标记与耐逆性状的关联分析。
