1. 研究目的与意义
研究内容1. 明确Oroxylin A改善酒精性肝炎与其调控肝细胞焦亡途径相关1.1体外研究Oroxylin A对肝细胞焦亡关键因子蛋白与基因表达的影响，包括炎症小体NLRP3、斑点样蛋白ASC、caspase-1、caspase-4、caspase-5、gasdermin蛋白家族成员GSDMD，明确Oroxylin A体外缓解肝细胞焦亡。
2. 明确炎症小体NLRP3介导了Oroxylin A对肝细胞焦亡的抑制作用2.1体外研究Oroxylin A对焦亡肝细胞中NLRP3的表达的影响，明确Oroxylin A体外缓解NLRP3通路活化；2.2利用NLRP3特异性抑制剂MCC950作用于培养的肝细胞，检测炎症因子及焦亡标志物表达的影响，明确NLRP3介导了肝细胞焦亡信号通路。
3. 明确Oroxylin A调控NLRP3活化及肝细胞焦亡的具体机制3.1体外探究Oroxylin A对于Mfn2干扰的影响，检测炎症小体活化通路、线粒体活性氧、内质网应激通路的变化，明确Oroxylin A通过促进Mfn2进而缓解炎症小体活化和氧化应激通路激活。
2. 文献综述
NLRP3炎症小体在肝纤维化中的作用机制刘雨洁1，郑仕中1，2，3，41.南京中医药大学药学院，南京210023；2.江苏省中药药效与安全性评价重点实验室，南京210023；3.江苏省中药功效物质重点实验室，南京210023；4.中药品质与效能国家重点实验室（培育），南京210023摘要：NLRP3炎症小体是一种细胞内多蛋白复合物，能识别来自损伤细胞和病原生物释放的信号分子，介导 caspase-1活化，从而剪切活化细胞因子IL-1β和IL-18，同时也可以诱导其他促炎因子的活化和释放。
NLRP3炎性小体作为固有免疫的重要组分在机体免疫反应和疾病发展过程中具有重要作用，其活化与多种肝病发病机制有密切关系。
本文系统阐述炎症小体的功能、活化机制及在肝纤维化中起到的关键作用，并对近年来相关机制研究进行综合、整理和归纳，为抗肝纤维化研究及药物研发提供新的视角。
3. 设计方案和技术路线
研究方案：1. 探究炎症小体NLRP3是否介导了Oroxylin A对肝细胞焦亡的抑制作用1.1 体外研究Oroxylin A对焦亡肝细胞中NLRP3的影响采用无水乙醇（200mM）对LO2细胞造模48小时，再给药Oroxylin A（10、20、40μM）24小时，之后提取mRNA与蛋白。
Real-time PCR检测NLRP3 mRNA表达，Western blot检测NLRP3蛋白的表达。
加入NLRP3特异性抑制剂MCC950检测药物对炎症因子及焦亡标志物表达的影响。
4. 工作计划
2022年2月-2022年3月1）搜集阅读相关文献；2）体外研究Oroxylin A对细胞焦亡关键蛋白及炎症因子的影响，包括炎症小体NLRP3、斑点样蛋白ASC、caspase-1、caspase-11、gasdermin蛋白家族成员GSDMD、炎症因子IL-1β、IL-18。
2022年4月-2022年5月1）体外研究Oroxylin A是否通过调控NLRP3进而调控肝细胞焦亡，使用NLRP3特异性抑制剂MCC950检测药物对炎症因子及焦亡标志物表达的影响；2） 体外研究Oroxylin A是否通过调控Mfn2进而影响NLRP3通路最终缓解肝细胞焦亡，采用Mfn2干扰RNA后检测线粒体ROS、内质网应激、钙离子含量、NLRP3通路的变化；3）整理资料，撰写论文。
5. 难点与创新点
在细胞与分子水平上利用体外实验，探索Oroxylin A通过调控肝细胞焦亡对酒精性肝病的影响及具体分子机制，明确Oroxylin A是如何通过调控细胞焦亡进而影响酒精性肝病的，为进一步全面阐释酒精性肝病的发病机理及治疗提供新的思路，为筛选酒精性肝病治疗药物提供理论依据。
