1. 研究目的与意义
论文内容： 本研究基于 Crispr/Cas9系统探索对大肠杆菌的基因组进行改造。
首先本研究获得了Crispr/Cas9系统的两个质粒pCas9和TargetF，分别用于表达切割蛋白Cas9和敲除靶标gRNA。
本研究尝试敲除生物素合成途径中的关键基因AONS。
2. 文献综述
CRISPR-Cas9的原理及其在基因编辑的应用季倩敏 047214140摘要 CRISPR-Cas9系统是近年来发展迅速的一项基因定点修饰技术。
它是基于细菌或古细胞CRISP介导的获得性免疫系统衍生而来的一段聚集的有规律的间隙短回文。
由一段RNA通过碱基互补配对识别DNA，指导Cas9核酸酶切割别的双链DNA，引导同源重组或非同源末端连接，从而完成在目的基因的编辑。
3. 设计方案和技术路线
研究方案：1.对宿主菌的ANOS进行扩增和测序2.分别从工程菌中提取pCas9和Target F质粒3.将 pCas9质粒导入宿主细胞E.coli4.利用Crispr/Cas9在线系统分析设计20个碱基的敲除靶标5.通过反向PCR,以Target F质粒为模板，构建敲除质粒Target-N20通过重叠PCR技术，构建敲除片段6.将构建好的敲除质粒TargetF-N20和敲除片段导入已有pCas9质粒的E.coli7.通过卡那霉素 大观霉素抗性对突变株进行筛选，通过PCR测序进行验证，通过37度培养和 IPTG消除质粒，获得无抗性的基因编辑菌株 8.通过生物素的检测对AONS基因敲除菌株是否对生物素的生物合成发挥作用进行研究验证。
技术路线：质粒pCas9提取，pCas9导入大肠杆菌，质粒Target F提取，确认靶标，构建筛除质粒，构建敲除片段，含敲除片段的大肠杆菌，筛除Target F，筛除pCas9，得到最终突变株
4. 工作计划
第一阶段：1-2月 查阅文献，撰写综述。
第二阶段： 3 月 克隆获得ANOS基因，进行基因测序，设计敲除靶点，分离pCas9和TargetF两个质粒。
第三阶段： 4 月通过反向PCR设计和构建敲除质粒，通过重叠PCR的方法构建敲除片段。
5. 难点与创新点
虽然CRISPR/Cas9被发现的历史并不久，但其在工业和学术领域方面的应用已经非常广泛。
以往基于同源交换的遗传改造技术相对比较费时费力，需要构建繁琐的系统和复杂的质粒。
而CRISPR/Cas9因其可以特异性的对目标靶点进行识别，并进行切割，因此快速方便的对细菌基于组进行改造，因此极大的提高了代谢工程的效率，为合成生物学的研究奠定基础。
