1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
大豆疫霉(Phytophthorasojae)引起的大豆根茎腐病是威胁全世界大豆生产的毁灭性病害之一[1][2]，每年导致全世界10-20亿美元的损失[3]。研究大豆疫霉在侵染大豆过程中效应分子如何激发或抑制植物免疫反应对于揭示病原菌的侵染机制非常重要[4]。
效应分子（effectors）是由病原菌分泌的、可以改变寄主植物细胞的结构和代谢途径，从而促进对寄主植物成功侵染的或者触发寄主防卫反应的一类外泌型蛋白分子[5]。目前认为卵菌可以分泌几百个效应分子分别作用于寄主植物的不同位点[5][6]。一类是定位于寄主细胞质外体的效应分子，作用于胞外靶标和膜表面受体，如疫霉属植物病原卵菌分泌抑制寄主植物葡聚糖酶和蛋白酶的抑制因子以抑制植物病程相关蛋白的攻击，此外，许多真核病原菌的无毒基因都编码一些小的（150aa）包含偶数个半胱氨酸残基的分泌蛋白，形成稳定的二硫桥对于植物抗性的诱导以及无毒基因的功能非常重要[7][8]；另外一类能够进入寄主细胞内的效应分子，包括能被植物抗病蛋白识别的无毒蛋白、RxLR效应蛋白和CRN蛋白家族（CRN1，CRN2）等，CRN1和CRN2类似于细菌效应分子作为效应蛋白干扰寄主细胞代谢，RxLR类效应分子可通过多种途径干扰植物的免疫反应[9][11]。
现在研究认为植物的免疫系统包括两个层面[10]，其与病原的互作可以总结为一个之字形模式：首先是植物细胞膜上的跨膜受体(PatternRecognitionReceptors,PRRs)识别病原菌MAMPs/PAMPs(Microbial-orPathogen-associatedMolecularPatterns),激发了基础防卫反应，能够阻碍病原物的进一步扩展，即PAMP-TriggeredImmunity(PTI)。而病原物则分泌效应分子来干扰和破坏寄主的PTI反应，增加病原物的毒性，最终导致寄主感病(Effector-TriggeredSusceptibility,ETS)。ETI是一种加速和强烈的抗病反应，一般表现为在侵染位点出现过敏性细胞死亡(hypersensitivecelldeathresponse,HR)[11]。当然，在强大的自然选择压力的驱动下，新的效应分子和新的抗病基因以及ETI在病原物和植物的协同进化中不断产生，而这种植物与病原之间类似于军备竞赛的武器升级也会在共同进化的过程中不断地延续下去[10]。
2. 研究的基本内容和问题
目标：研究大豆疫霉无毒效应分子Avr3b对植物细胞内NAD(P)、NAD(P)H的水解作用及氧化还原平衡的影响，进一步阐释Avr3b在病原菌侵染过程中的毒性功能。
内容：通过农杆菌介导的瞬时表达在烟草上分别瞬时表达Flag-Avr3b和Flag-GFP（作为对照）。烟草叶片中NAD(P)、NAD(P)H分别用0.1MHCl和0.1MNaOH提取，利用酶循环法检测烟草中NAD(P)、NAD(P)H的浓度，确定Avr3b对植物细胞内NAD(P)、NAD(P)H的浓度的影响；并通过试剂盒检测GSH(还原型谷胱甘肽)和GSSG(氧化型谷胱甘肽)含量与比率，研究Avr3b对植物细胞内氧化还原平衡的影响。
拟解决的关键问题：Avr3b调节寄主细胞氧化还原平衡的分子机制。
3. 研究的方法与方案
A．农杆菌转化：
a)在冷却的1.5mLEP管中加入100L冰浴中解冻或新制备的感受态细胞悬浮液和3L质粒DNA。轻轻混匀后冰上放置约30min。
b)将上述冰浴后的EP管在液氮中速冻1min后，放入37℃热水浴中5min。
c)立即加入950LLB培养液，200rpm，28℃恢复培养4h。
d)5000rpm离心3min收集细胞，涂布于含50g/mL的卡那霉素的LB选择性平板上。30℃培养2d后长出的菌落即为阳性克隆。
B．烟草瞬时表达Avr3b：
a)将阳性克隆于3mL添加kanamycin（50μg/ml）的LB培养液中，200rpm，30℃培养36-48h，4000rpm离心4min收集菌体。
b）用10mMMgCl2重悬，重复三次后，用10mMMgCl2定容至OD600=0.6。
c）用针头在烟草下表皮造成一小伤口，用1mL无针头的注射器将农杆菌悬液渗透接种到4-6周的本氏烟叶片中，在温室中培养48h。
C．NAD(P)、NAD(P)H的提取和测定
a）用0.1mMHCl/0.1mMNaOH研磨烟草提取NAD(P)/NAD(P)H，沸水浴5min后冷却至0℃，4℃12000g离心10min，将上清转移至新管并中和，冰上保存待测定。
b)测定NAD(H)酶循环反应体系：
组成成分规格体积L |
Bicinebuffer0.1mol/L(pH7.4)375 PES4.0g/L40 MTT5.0g/L20 EtOH分析纯15 Sample50 ADH1U/L1 |
测定NADP(H)酶循环反应体系：
组成成分规格体积L |
Bicinebuffer0.1mol/L(pH7.4)363 PES4.0g/L40 MTT5.0g/L20 EtOH分析纯15 Sample50 G-6-P0.184M5 G-6-PDH0.2U/L2 |
c)用酶标仪测定OD570。每10s测定一次，共测定5min。
D．试剂盒检测GSH和GSSG
a）总谷胱甘肽样品：取注射过GFP和Avr3b的烟草叶片各0.4g用液氮速冻，然后研成粉末。每10mg研碎的组织粉末，加入30L蛋白去除试剂M溶液，充分Vortex。再加入70L蛋白去除试剂M溶液，用玻璃匀浆器充分匀浆。样品在4℃放置10min后，10000g4℃离心10min，取上清用于总谷胱甘肽的测定。
b）测GSSG含量：取部分上述准备好的待测总谷胱甘肽含量的样品，按照每100L样品加入5L稀释的GSH清除辅助液的比例加入稀释的GSH清除辅助液，立即vortex混匀。再按照每100L样品加入1LGSH清除试剂工作液的比例加入GSH清除工作液，立即vortex混匀，25℃反应60分钟。
c）将待测样品每10L加入150L总谷胱甘肽检测工作液后，混匀，室温孵育5min，加入50L0.16mg/ml的NADPH溶液，混匀。立即用酶标仪测定A412。每5min测定一次，共测定25min，测得5个数据。
技术路线：（见附件）
可行性分析：项目申请者所在实验室主要研究卵菌的致病机理，在长期的研究中已积累大量工作经验和实验技术，为本实验的实施奠定了基础。参考相关文献后归纳总结出实验步骤，且实验室基础设施完善，所以本实验完全可行。
4. 研究创新点
目前，卵菌和真菌无毒效应分子的毒性功能很大程度上是未知的，不同的效应分子可作用于不同的信号通路干扰植物的防卫反应。本实验室首次报道卵菌RxLR-Nudix效应分子Avr3b后，其如何通过调节植物细胞代谢进而降低植物的抗病性还需进一步研究。本实验将首次使用生物化学的手段分析Avr3b对植物内源含二磷酸核苷类物质的水解作用以及氧化还原平衡的影响从而揭示卵菌效应分子抑制植物防卫反应的新机制。
5. 研究计划与进展
研究计划：
2014.9-10阅读文献，参考资料，熟悉课题内容。
2014.10-11配制培养基、试剂，农杆菌转化。
