1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
芽孢杆菌属 Bacillus，包括枯草芽孢杆菌 B. subtilis 和解淀粉芽孢杆菌 B. amyloliquefaciens 等是一类重要的植物根围促生细菌[1,2]。这类细菌能产生多种生防活性物质，如抗菌促生物质以及蛋白酶类等。这些物质在芽孢杆菌防治植物病害中起着重要作用 [3-5] 。芽孢杆菌还能产生抗逆性较强的芽孢，适合工业规模化生产 [6] 。在国外，已经有许多芽孢杆菌被开发成商品化的生防制剂，如 GB03、QST713 和 FZB42 等。在国内，商品化的菌株有 B3、B903、B908、B916、BL03 和 XM16 等[7] 。
芽孢杆菌通过非核糖体途径合成抗菌物质脂肽化合物泛革素（fengycin）、表面活性素（surfactin）和伊枯草菌素（iturin）。其中，泛革素对多种丝状真菌具有很强的抑制效果[8] ，还能作为激发子诱导植物产生诱导性系统抗性（ISR）[9] 。表面活性素具有抑制病毒和细菌活性能力[10]，还对细菌的群集运动（swarming）以及生物膜的形成起着重要作用[11,12]。伊枯草菌素能有效抑制真菌和细菌。泛革素由 10 个氨基酸组成的多肽和 1 个 C 13-17 -β-羟基脂肪酸链构成，其中多肽上第 3 和第 10 位的氨基酸通过内酯键形成环状结构，根据环肽上氨基酸的不同分为 fengycin A、fengycin B 和 fengycin C [13,14]。泛革素合成酶操纵子（pps operon）含有 5 个开放阅读框，编码 PpsA-E 5 个蛋白，组成 10 个氨基酸活化模块。泛革素具有很强的抑制真菌的活性，它能够穿透磷脂双分子层，打破脂质层的有序性，增强细胞质膜的渗透性，从而破坏细胞，是一种有效的磷脂及生物膜合成抑制剂[15,16]。
已有报道证明，泛革素对番茄灰霉病菌 Botrytis cinerea 表现较强的拮抗活性，能造成灰霉病菌菌丝膨大畸形，部分原生质体外渗[17] 。泛革素还在解淀粉芽孢杆菌 CO6 防治桃褐腐病中起主要作用[18]。枯草芽孢杆菌 168 是研究芽孢杆菌的模式菌株，其全基因组序列于 1997 年完成测序[19]。泛革素由非核糖体肽合成酶（non-ribosomal peptide synthetases，NRPSs）合成。这类多酶复合体都由多个模块（modules）按特定的空间顺序排列而成，每一个模块负责将一个特定的底物整合到产物的骨架中 。NRPSs 还需 4′-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶（sfp 基因编码）进行修饰，才具有全酶活性[20]。168 菌株虽然含有完整的泛革素合成酶基因簇[21]，但由于合成非核糖体肽所需的 sfp 基因突变，因此不能合成此类抗菌物质[22]。但仅转 sfp基因的 168 菌株泛革素产量仍然很低，原因是其 degQ 的启动子区-10 位置上的一个碱基 T 突变成了 C，因此该菌株不能表达 DegQ [23]。而 degQ 是广泛存在于芽孢杆菌中的多效性因子，编码一个 46 个氨基酸的多肽，能够调控多种外泌酶的表达和抗菌物质的产量。但 degQ 调控泛革素合成的机理仍不清楚。
2. 研究的基本内容和问题
本研究准备构建 168-sfp、168-degQ-sfp、168△degU-sfp、168△degU-degQ-sfp 4株基因工程菌株。
利用抑菌试验和质谱分析各菌株的泛革素产量。
从而判断degQ是否通过degU/degS途径影响fengycin的产生。
3. 研究的方法与方案
（1）、将这两个载体分别转入到BS168中，已知168-sfp产生surfactin，168-degQ-sfp产生surfactin与fengycin（李响，2015）（2）、敲除BS168的degU后，再次分别转入pMK3-sfp与pMK3-degQ-sfp后，若168△degU-sfp产生surfactin， 168△degU-degQ-sfp产生surfactin而不产生fengycin，则可说明degQ确实通过degU/degS途径影响fengycin的产生（3）、同时结合EMSA实验,蛋白水平上验证fengycin启动子可与degU蛋白可以结合
4. 研究创新点
本实验同时在基因水平以及体外蛋白水平两方面进行验证degQ是否通过degU/degS途径影响fengycin的产生。
5. 研究计划与进展
168-sfp、168-degQ-sfp、168△degU-sfp、168△degU-degQ-sfp已经构建成功，同时体外EMSA实验也已经完成： 1：fengycin启动子 2：degU蛋白 3：degU蛋白 fengycin启动子 EMSA结果说明degU蛋白和fengycin启动子可以结合。
