缺氮和复氮处理对菘蓝幼苗生长及部分生理生化指标的影响开题报告

本课题的意义、国内外研究概况、应用前景等（列出主要参考文献）

菘蓝(IsatisindigoticaFort.)为十字花科(Brassicaceae)菘蓝属(IsatisLinn.)2年生草本植物，其干燥叶为常用中药材材大青叶，具有清热解毒、凉血消斑的功效；其干燥根为中药板蓝根,具有清热解毒、凉血消肿和利咽的功效[1]。现代以大青叶制成的靛玉红片内服，对治疗慢性粒细胞性白血病有较好疗效[2]。近年来，对菘蓝叶片的研究主要集中在化学成分、药理作用、有效成分的提取等方面。菘蓝的主要化学成分有：靛苷、靛蓝、靛玉红等吲哚类生物碱、色胺酮等喹唑酮类化合物、芥子苷类化合物、表告依春、告依春等含硫类化合物、木酯素、黄酮类、有机酸类、碱基核苷类、氨基酸类、多糖、甾醇等[3-8]。菘蓝可治疗流行性腮腺炎、病毒性肠炎、尖锐湿疣、乙型肝炎、传染性肝炎、甲型流感病毒、扁平疣等病毒性疾病[9]。菘蓝有调节免疫细胞分泌IL-2、TNF-α及提高细胞免疫功能的作用[10]，还有抗活性氧、抗炎抗菌作用、活血的作用以及抗内毒素的作用[11-13]。

氮素为植物生长过程中最重要的营养元素,它不但是植物最重要的结构物质,而且是各种酶类的主要组成元素,对植物的生理代谢和生长均具有重要作用。氮素可通过影响植物叶绿素含量、光合速率、暗反应主要酶活性以及光呼吸速率等直接或间接影响植物的光合作用[14]。施肥量对于植物的产量和品质都具有一定的影响:施肥量过少,不能满足植物生长的基本需求,造成植株发育较差、矮小,叶片黄化,根部细长,产量偏低等问题[15]，氮素亏缺的西洋参(PanaxquinquefoliumL.)发育较差，植株矮小，叶片黄化，根部细长，产量较低;施肥量过多,不但造成肥料浪费、增加生产成本以及污染环境等问题,且有可能影响植物的产量和品质、导致幼苗成活率下降[16],由于丹参(SalviamiltiorrhizaBunge.)需大量人工种植，在移栽时若氮素过多，会影响幼苗的成活率，即使成活也会出现烧苗现象。对于药用植物来说,还很可能会导致硝酸盐含量超标[17],降低药材的品质。

近年，对菘蓝栽培生理等方面的研究已有进展，不同的氮素形态和浓度对菘蓝生物量和活性成分含量的影响存在很大差异，酰胺态氮对菘蓝生物量的影响最大，其次是铵态氮，影响最小的是硝态氮，生物量并不随着总氮量提高而增加，而与氮素形态有关[18]。在不同形态氮素中酰胺态氮显著影响了菘蓝的气孔导度与蒸腾速率[19]。同一氮素水平不同氮素形态对菘蓝活性成分累积及4种矿质元素吸收的影响也存在差异[20]。但是氮素的盈亏对于菘蓝幼苗生长及部分生理生化指标的影响方面的研究较少，仅见施晟璐[21-22]等人缺氮和复氮处理对苗期菘蓝营养和活性成分以及氮代谢的影响的研究，在缺氮复氮处理下菘蓝幼苗光合参数及相关酶活性方面的研究尚未见报道，为此本实验通过水培方式对菘蓝幼苗进行缺氮和复氮处理，考察菘蓝的生长、光合参数及相关酶活性对氮素盈亏的响应特征，旨在了解氮素盈亏对菘蓝生长及部分生理生化指标的影响，为实际生产中获得高品质的板蓝根和大青叶药材，提高氮素利用效率提供理论依据。

参考文献：

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研究的目标、内容和拟解决的关键问题

研究目标

以山西栽培居群的菘蓝为材料，采用水培的方式进行对照试验，测定菘蓝单株根和叶片的鲜重与干重、净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、胞间CO2浓度(Ci)和蒸腾速率(Tr)、部分酶活性包括谷氨酸脱氢酶(GDH)、谷氨酸合成酶(GOGAT)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性以及丙二醛(MDA)含量，以研究缺氮和复氮处理对菘蓝幼苗生长及部分生理生化指标的影响，为菘蓝栽培生产过程中氮肥的高效利用研究提供参考依据,并为高质量和高品质大青叶药材的生产提供施肥策略。

研究内容

（1）在同一条件下测定缺氮、复氮以及正常处理组（Hoagland基本营养液）的单株叶和根的鲜重与干重，明确缺氮和复氮处理岁菘蓝幼苗生长的影响。

（2）测定三个处理组光合和气体交换参数包括叶片的净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、胞间CO2浓度(Ci)和蒸腾速率(Tr)。

（3）测定各处理组部分酶活性包括谷氨酸脱氢酶(GDH)、谷氨酸合成酶(GOGAT)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性以及丙二醛(MDA)含量，明确缺氮和复氮处理对菘蓝幼苗部分生理生化指标的影响，为提高氮肥利用率提供依据。

拟解决的关键问题

（1）明确缺氮和复氮处理对菘蓝幼苗生长的影响。

（2）探究缺氮和复氮处理对菘蓝幼苗部分生长指标的影响，为菘蓝栽培生产过程中氮肥的高效利用研究提供参考依据。

研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析

研究方法

（1）单株叶和根质量的测定处理结束当天在每个培养箱中随机选取10株幼苗,将根和叶片分开,用测量精度0.0001g的分析天平分别称量单株根和叶片的鲜质量；然后置于105℃烘箱内杀青15min，再于60℃烘干至恒质量,分别称量单株根和叶片的干质量。结果取平均值。

（2）光合和气体交换参数的测定在处理结束当天的9:00至11:00,在室外用LI-6400便携式光合作用测量系统(美国LI-COR公司)测定植株上由内至外完全展开的第2轮功能叶片中部的净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、胞间CO2浓度(Ci)和蒸腾速率(Tr)；测定时的光照强度设为1000molm-2s-1。每个培养箱均随机选取5株幼苗进行测定,每株重复测定5次，结果取平均值。

（3）酶活性及丙二醛(MDA)含量的测定采集每个周转箱中剩余25株幼苗的叶片，混匀后，分别称取0.5g新鲜叶片用于酶活性和MDA含量的测定。按照Zhang等[11]的方法制备粗酶液，并参照Lin等[12]的方法测定谷氨酸脱氢酶(GDH)活性、参照Singh等[13]的方法测定谷氨酸合成酶(GOGAT)活性，均以1min内A340下降0.001为1个酶活力单位。按照A084-3试剂盒(南京建成生物工程研究所)说明书上的操作流程测定过氧化物酶(POD)活性。用pH为7的磷酸缓冲液制备粗酶液,采用氮蓝四唑(NBT)还原法[14]测定超氧化物歧化酶(SOD)活性(以抑制50%NBT光氧化还原为1个酶活力单位)、采用紫外吸收法[15]169-170测定过氧化氢酶(CAT)活性(以1min内A240降低0.1为1个酶活性单位)、采用硫代巴比妥酸(TBA)显色法[15]280-281测定MDA含量。各指标测定均设3次重复,结果取平均值。

技术路线

实验方案

（1）实验材料实验材料为来自山西栽培的普通菘蓝居群，经南京农业大学王康才教授鉴定为十字花科植物菘蓝IsatisindigoticaFort.，取籽粒饱满、大小均一的菘蓝种子，实验地设在南京农业大学园艺学院实验室及实验基地的塑料大棚内，菘蓝种子于2015年7月7日在昼温25℃、夜温15℃、光照时间18hd-1、光照度20000lx的人工气候培养箱中催芽72h；待幼苗萌出后移入装有等体积蛭石和有机质的32孔穴盘中，每穴栽植1株,置于上述条件的人工气候培养箱中继续培养。待幼苗长至6或7片真叶时，将幼苗移入装有相同混合基质的塑料花盆(上口径23.5cm、高度27.0cm)中，每盆栽植3株，置于室内自然光照下培养1个月，每2天浇1次水。在周转箱中加入6LHoagland基本营养液，并在培养箱上加盖具40孔的泡沫板，将幼苗分别插在泡沫板孔中，每孔1株，置于上述条件的人工气候培养箱中预培养7d。

水培时，Hoagland基本营养液和缺氮营养液均为pH6.0，并且均含616.18mgL-1MgSO47H2O、272.18mgL-1KH2PO4、1.14mgL-1MnSO4H2O、0.08mgL-1CuSO45H2O、0.22mgL-1ZnSO47H2O、2.86mgL-1H3BO3、0.09mgL-1H2MoO4和8.42mgL-1mgL-1EDTAFeNa;Hoagland基本营养液中另含505.55mgL-1KNO3和1180.75mgL-1Ca(NO3)24H2O，缺氮营养液中另含372.80mgL-1KCl和555.00mgL-1CaCl2。

（2）实验设计将经过预培养的菘蓝幼苗分成3组，分别为对照组、缺氮处理组和复氮处理组，每组3个周转箱，视为3个重复。其中，对照组(正常供氮)用Hoagland基本营养液培养15d；缺氮处理组用缺氮营养液培养15d；复氮处理组先用Hoagland基本营养液培养6d，然后用缺氮营养液培养4d，再用Hoagland基本营养液培养5d，总计培养时间也为15d。各组每2天更换1次营养液。

可行性分析

（1）客观条件（栽培条件，实验室条件，仪器设备条件等）

①课题研究思路明确，技术方案可行。本项目依托于中药学教学实验中心和园艺学院科研平台。研究在中药学教学实验中心进行，中药学教学实验中心的栽培与质量分析实验室设施完备，在试验基地、实验方法和仪器设备条件等方面均已成熟，故此研究切实可行。

②高效液相色谱仪、高速台式冷冻离心机、分光光度计等必备的仪器设施齐全；

③部分药品、试剂可直接从实验室获取。

主观条件（指导老师，个人实验基础）

项目由长期从事菘蓝研究的专业导师指导，并且指导老师在菘蓝的质量控制方面已有深入研究。本人是中药专业学生，学过无机化学、有机化学、生物化学以及植物生理学等课程，有一定的理论基础；同时参与过国家大学生创新性实验项目并作为项目主持人顺利结题，仪器使用熟练，动手能力较强；在实验开始前，阅读过大量的相关文献，制定了完备、可靠的实验方案，准备工作充足。

综上所述，本实验可行。

特色或创新之处

目前关于菘蓝的研究主要集中在化学成分、药理活性、制剂工艺、临床应用等方面，关于菘蓝缺氮复氮处理后幼苗的生长、光合及生理生化指标的影响未见报道。氮素是植物生长所必需的大量元素，其供应会直接影响植物的生长和次生代谢物的积累。氮素能使植物枝干高大，生长茂盛，而缺氮植物往往表现为植株矮小、叶片发黄，严重缺氮时叶片变褐甚至死亡。然而也有些植物在缺氮胁迫下仍能生长，如柳枝稷，但长时间缺氮必定影响植物初生及次生代谢过程，对于药用植物而言必定影响其营养状况和活性成分的含量。若施氮过多则不仅会导致肥料的浪费，还会造成环境的污染。缺氮复氮处理对于菘蓝的影响的相关研究仅见施晟璐等人缺氮和复氮处理对苗期菘蓝营养和活性成分以及氮代谢的影响的研究，对其光合、酶活性等方面的影响尚未见报道，为此本实验采用水培的方式，研究缺氮和复氮处理对菘蓝幼苗生长及部分生理生化指标的影响，为实际生产中获得高品质的板蓝根和大青叶药材，提高氮素利用效率提供理论依据。

研究计划及预期进展

研究计划

本研究预期在24个月内完成，2014年6月-2016年5月

2014年6月：进行前期工作，查找文献资料，完成研究方案的设计。

2014年7月8月：预培养菘蓝幼苗，观察菘蓝生长情况。

2014年9月：对苗期菘蓝进行对照处理，用营养液分别培养。

2014年9月：测定菘蓝幼苗根与叶片鲜重与干重、净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、胞间CO2浓度(Ci)和蒸腾速率(Tr)。

2014年10月2015年12月：测定菘蓝幼苗谷氨酸脱氢酶(GDH)、谷氨酸合成酶(GOGAT)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性及丙二醛含量。

2015年2月2015年5月：分析实验结果，处理数据，并且完成1篇项目论文并进行修订。

2016年3月2016年5月：撰写、修改毕业论文，完成毕业论文答辩。

预期进展

明确缺氮和复氮处理对菘蓝幼苗生长、光合和气体交换参数、谷氨酸脱氢酶(GDH)、谷氨酸合成酶(GOGAT)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性及丙二醛含量的影响，为菘蓝栽培生产提供合理的氮肥施依据。