1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
肌肉蛋白一直以来都被视为富含营养甚至生物功能特性的优质蛋白质来源，存在诸多其他食物难以取代的优点。它的营养特性与其氨基酸成分、生物利用率和消化过程中产生的功能活性肽息息相关 [1]。
迄今为止，研究人员发现不少畜禽鱼肉类蛋白在加工过程或人体内消化过程中降解成生物活性肽，包括抗高血压肽，抗血栓肽，阿片类肽，免疫调节肽，抗菌肽和抗氧化活性肽 [2-4]，其中血管紧张素转化酶抑制肽(angiotensin-I-converting enzyme inhibitory, ACEI)和抗氧化肽两种功能肽尤为常见 [5] 。研究表明，在猪肉消化产物中发现的VKKVLGNP（肌球蛋白）、RMLGQTP（肌钙蛋白）、KAPVA（肌联蛋白），在鸡肉消化产物中发现的FQKPKR（肌球蛋白）和鱼肉消化产物中的IWHHT（肌动蛋白）等在体外试验中都可抑制血管紧张素转换酶的活性 [6-8] 。近期也有科学家通过自发性高血压大鼠模型的营养干预的定量实验研究得出各种ACEI肽的半抑制浓度和阈值 [9] 。
Erdmann等 [10] 认为这些生物活性肽可以被肠粘膜吸收或直接在肠腔中发挥作用，可能对心血管疾病能起到一定的预防作用。心血管疾病是世界卫生组织预测的，
2. 研究的基本内容和问题
本课题以黑腹果蝇为实验对象，选择鸡胸肉和猪里脊肉为代表，于体外消化后配置含不同浓度消化液的培养基，研究体外消化动物肌肉蛋白与果蝇寿命和繁殖力之间的量效关系，以及对果蝇基因表达和抗氧化方面的影响。
研究内容主要包括：体外消化动物肌肉蛋白对果蝇寿命、繁殖力、抗氧化能力、世代抗氧化能力、基因表达能力和酶活性的影响。
试验主要需要解决的问题是：如何减少客观因素造成的果蝇死亡对试验的影响。
3. 研究的方法与方案
1.果蝇的饲养
果蝇培养基配方及添加顺序
①将水烧开，加入白糖
②趁热缓慢加入玉米，缓慢搅拌，防止冒泡烫伤
③将琼脂用凉水化开，趁热加入，并搅拌
④等液体放凉后（不烫手），加入用凉水化开的酵母
⑤加入丙酸
⑥加水至预定体积
⑦在凝固之前倒入牛奶瓶，尽量不要粘在壁上
mL | 100 | 200 | 300 | 400 | 500 | |
1 | 白糖 g | 8.7 | 17.4 | 26.1 | 34.8 | 43.5 |
2 | 玉米 g | 11.4 | 22.8 | 34.2 | 45.6 | 57.0 |
3 | 琼脂 g | 0.7 | 1.4 | 2.1 | 2.8 | 3.5 |
4 | 酵母 g | 0.34 | 0.68 | 1.02 | 1.36 | 1.70 |
5 | 丙酸 ml | 0.54 | 1.08 | 1.62 | 2.16 | 2.70 |
mL | 600 | 700 | 800 | 900 | 1000 | |
1 | 白糖 g | 52.2 | 60.9 | 69.6 | 78.3 | 87.0 |
2 | 玉米 g | 68.4 | 79.8 | 91.2 | 102.6 | 114.0 |
3 | 琼脂 g | 4.2 | 4.9 | 5.6 | 6.3 | 7.0 |
4 | 酵母 g | 2.04 | 2.38 | 2.72 | 3.06 | 3.40 |
5 | 丙酸 ml | 3.24 | 3.78 | 4.32 | 4.86 | 5.40 |
2.体外消化动物肌肉蛋白
提取脂肪 将肉中所有可见的脂肪和结缔组织去掉，切成小肉块，称重后冻干，称重，用研钵研磨成粉，称取2g用滤纸包住，放入索氏抽提装置中，用乙醚提取脂肪，反复抽提12h。将滤纸包裹的肉样放入通风厨，使乙醚充分挥发。留取一部分肉样用于测定脂肪、粗蛋白、能量等指标。
体外消化 将另一部分肉样转入10 ml离心管中，72℃水浴30min，加入1M HCl调节pH2.0，按体重比1:31.25加入胃蛋白酶，于37℃震荡消化2 h，加入1 M NaOH调节pH7.5终止消化，按体重比1:50加入胰蛋白酶，于37℃震荡消化2 h，95℃放置5 min终止消化。消化液加入三倍体积的乙醇4℃放置12 h去除未消化的蛋白质，3000g离心20min，取上清，冻干后用于后续试验分析。
试验分为2个处理（A肉和B肉），每处理3个浓度（0%，1%和10%）
3.实验方案
3.1 试验一 体外消化动物肌肉蛋白对果蝇寿命的影响（600只）
5个试验处理，空白，1%鸡肉，10%鸡肉，1%猪肉，10%猪肉。
每个浓度8管（4管雌性，4管雄性），每个试管15只果蝇。
收集10h内羽化的未交配处女果蝇，用乙醚麻醉后区分雌雄，放入相应的试管中，每日观察记录各管果蝇的存活和死亡个数，直至全部死亡。计算每组的半数死亡时间，平均寿命和最高寿命（每组最后存活的20只果蝇的平均寿命）。
3.2试验二 体外消化动物肌肉蛋白对果蝇繁殖力的影响（560只）
5个试验处理，空白，1%鸡肉，10%鸡肉，1%猪肉，10%猪肉。
每个浓度8管，每个试管7对雌雄果蝇。
收集10h内羽化的未交配处女果蝇，用乙醚麻醉后区分雌雄，放入相应的试管中，培养7d后去除亲本（F0代）果蝇，从第10d天开始统计各管羽化的子代果蝇数，连续统计8d。
3.3试验三 体外消化动物肌肉蛋白对果蝇世代抗氧化的影响（600只）
3个试验处理，空白，10%鸡肉，10%猪肉。
每个浓度10管，每个试管10对雌雄果蝇。
收集10h内羽化的未交配处女果蝇，用乙醚麻醉后区分雌雄，放入相应的试管中，
培养7d后去除亲本（F0代）果蝇，收集10h内羽化的F1代果蝇，一部分用于测定基因表达，一部分放置于培养基中，培养7d后去除F1代果蝇，一部分用于测定基因表达，一部分放置于培养基中，培养7d后去除F2代果蝇
3.4 试验四 体外消化动物肌肉蛋白对果蝇基因表达的影响（750只）
5个试验处理，空白，1%鸡肉，10%鸡肉，1%猪肉，10%猪肉。
每个浓度10管（5管雌性，5管雄性），每个试管15只果蝇。
收集10h内羽化的未交配处女果蝇，用乙醚麻醉后区分雌雄，放入相应的试管中，培养40d后采样。
基因表达：将果蝇麻醉后放入Trizol中，按标准程序提取RNA，反转录得到cDNA，用RT-PCR方法检测抗氧化相关基因的mRNA表达水平。
3.5 试验五 体外消化动物肌肉蛋白对果蝇酶活性的影响（750只）
5个试验处理，空白，1%鸡肉，10%鸡肉，1%猪肉，10%猪肉。
每个浓度10管（5管雌性，5管雄性），每个试管15只果蝇。
收集10h内羽化的未交配处女果蝇，用乙醚麻醉后区分雌雄，放入相应的试管中，培养40d后采样。
酶活性：将果蝇麻醉后放入生理盐水中冰浴匀浆，4℃ 2500rpm离心20min取上清，用南京建成试剂盒测定SOD, CAT和MDA的含量。
3.6 试验六 急性氧化应激损伤试验（双氧水）（600只）
5个试验处理，空白，1%鸡肉，10%鸡肉，1%猪肉，10%猪肉。
每个浓度8管（4管雌性，4管雄性），每个试管15只果蝇。
收集10h内羽化的未交配处女果蝇，用乙醚麻醉后区分雌雄，放入相应的试管中，培养40d后用于试验。
将果蝇麻醉后转入干净无培养基的试管中，用滤纸条沾取少量含30%H2O2的6%葡萄糖水溶液插入果蝇管内，保证滤纸全部浸湿且没有液体留下，每2h记录果蝇的死亡数，直至果蝇全部死亡，期间每隔4h用注射器补给适量H2O2液体保证滤纸条湿润。同样，用20 mmol/l百草枯的6%葡萄糖水溶液代替H2O2溶液，记录果蝇的死亡数。
3.7试验六 急性氧化应激损伤试验（百草枯）（600只）
5个试验处理，空白，1%鸡肉，10%鸡肉，1%猪肉，10%猪肉。
每个浓度8管（4管雌性，4管雄性），每个试管15只果蝇。
收集10h内羽化的未交配处女果蝇，用乙醚麻醉后区分雌雄，放入相应的试管中，培养40d后用于试验。
4.可行性分析
本课题对操作技能要求不高，所有技能在以往课程中均有涉及，由朱老师提供技术和物资支持，可确保课题顺利完成。
4. 研究创新点
特色或创新之处
果蝇的许多代谢途径、生理学功能和发育阶段与哺乳动物具有高度的相似性，本实验以果蝇为研究对象，利用其生命周期短、繁殖速度快、子代数目多的优势，探究不同肌肉蛋白对果蝇寿命及其基因表达的量效关系，为人类的科学膳食提供一定的理论参考。
5. 研究计划与进展
2015年9月:实验果蝇扩增至足够数量，用于正式试验；准备实验试剂、器材等，培养瓶清洗。
2015年10月：按照试验顺序，配制各组试验用培养基，并按计划放入相应的处女蝇进行培养；定期更换培养基并按计划记录试验数据。
2015年11月：定期更换培养基并按计划记录试验数据；培养到期的试验组，将存活果蝇麻醉后做好标记冷冻保存备用（试验六和试验七于第40d直接进行试验）。
