1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
牛支原体是一种属于原生生物界、柔壁菌门、柔膜体刚，支原体目、支原体科、支原体属的原核细胞型微生物。该病原是环状双链DNA分子，基因组较小，约在830~1100kb，C G%较低，含量为27.8~32.9%，能够编码全部的必需氨基酸。牛支原体直径约为0.2~0.5μm，没有细胞壁，结构简单，细胞膜为典型的三层结构，仅有核糖体作为其唯一的细胞器，可以通过0.45μm的滤器。该病原常以二分裂和芽生方式进行增殖，形态上具有多形性呈现棒状、球状、丝状、椭圆状等，且具有一定的特异性。该病原虽然不具有水解氨基酸和发酵葡萄糖的能力，但是可以分解丙酮酸或者乳酸以提供维持生命所需的能源。在能够感染牛的20多种支原体中，牛支原体的致病力仅次于丝状支原体丝状亚种，是一种导致牛群引发相关疾病的重要病原微生物。
由于牛支原体没有细胞壁，所以该病原对磺胺类和β-内酰胺类等抗生素并不敏感。近年来采用药物来治疗牛支原体的相关疾病非但没有产生良好的疗效，还产生了耐药性的菌株。对于牛支原体疫苗的研制一直是近年来研究的热点，但是由于牛支原体自身抗原的多变性以及牛支原体能够逃避宿主的免疫机制，目前我国还未研制出针对该病原有效的商品化疫苗。虽然美国市场上存在两种美国农业部许可的用于预防牛支原体的兽用疫苗。但是根据报道，对两种疫苗进行了田间测试发现，这两种疫苗不能抑制牛支原体在呼吸道上的定植，在肺部病变组织的免疫保护率也只有44%和不足1%，且这两种疫苗不能够刺激机体产生相应的体液免疫应答，并不能够有效地防控牛支原体感染。
牛支原体是一种导致犊牛、肉牛、奶牛等患多种疾病的重要病原微生物。该病原不仅可以引发关节炎、乳房炎、角膜结膜炎、生殖道炎等，还可以与多杀性巴氏杆菌、睡眠嗜血杆菌、溶血性曼氏杆菌混合感染引发犊牛呼吸道综合征。该病原具有高度的传染性，一旦感染很难清除，目前牛支原体在世界范围内广泛传播，给全球养牛业带来了十分严重的经济损失。目前对于该病原的毒力因子以及致病机理仍不明确，抗生素治疗效果不明显，也没有效果显著的商品化疫苗，所以有针对性的防控和及时快速的诊断对目前牛支原体相关疾病的防治十分重要。本项目对我国部分省份及直辖市的养牛场的样品进行牛支原体的分离培养以及鉴定，并对分离株进行流行病学调查以及亲缘关系分析，为该病原在我国的实时监测以及制定有效的防控措施提供一定的帮助。
2. 研究的基本内容和问题
研究目标：本研究对我国部分省份及直辖市的养牛场的样品进行牛支原体的分离培养以及鉴定，并对分离株进行流行病学调查以及亲缘关系分析，为临床上牛支原体相关疾病的诊断以及防控提供一定的帮助。
研究内容：
本研究先对来自于我国部分省份的样品进行信息的采集，然后对样品进行处理，在配制好的培养基中进行培养，设计引物并提取培养物的DNA进行PCR鉴定，对所有的分离株进行流行病学分析。并选取部分牛支原体制作进化树，进行亲缘关系的分析。
3. 研究的方法与方案
1.分离培养：血样、奶样以及添加PBS的鼻拭子样品直接离心；组织脏器需要剪碎其明显病变部位，加入适量培养液后充分匀浆再离心。离心后的样品需要在无菌条件下通过一次性0.45μm滤器，离心，弃上清并混匀，分别取100μl处理后的样品接种于液体及固体培养基，同时配置阳性对照和阴性对照，阴性对照仅需添加培养液。接种后的培养基与阴阳对照置于37℃、5%CO2培养箱中培养48~72h。
2.形态学观察：培养完成后需对液体和固体培养基进行观察。先观察培养液是否澄清有无絮状沉淀，以判断是否在培养过程中受到污染，再观察培养液的颜色变化。培养皿应放置于光学显微镜下进行形态学观察。
3.PCR鉴定：为提取牛支原体核酸，先将培养液离心，弃一部分上清后煮沸再离心，其上清可作为PCR体系中的模板。参考石磊等人所报道的方法设计引物并配制体系进行PCR。将产物通过10 g/L琼脂糖凝胶电泳观察是否出现特异性的条带，并将扩增产物送至金斯瑞生物科技有限公司进行测序。
4. 研究创新点
1.本项目对牛支原体的分离培养以及检测的方法进行了改进，节省了人力物力，减少了检测的时间；
2.本项目对牛支原体多种不同的样品进行鉴定并综合性进行了对比和分析，包括肺脏组织样品，鼻拭子样品以及奶样等。
5. 研究计划与进展
2020年3月1日~2020年4月1日：查阅相关文献，购买实验所需试剂和器材，做好充足的实验准备；
2020年4月2日~2020年5月1日：牛支原体的分离鉴定，制作进化树以及流行病学以及亲缘关系分析；
2020年5月2日~2020年5月31日：实验论文的撰写。
