紫锥菊同源四倍体种质的诱导与鉴定开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

一、研究意义

紫锥菊属(E chiancea Moench)是原产于美洲的一类野生菊科花卉,也称“松果菊”。其主要特征是花托为圆锥形, 具有管状花和舌状花, 通常玫瑰色或紫色。该属共有8种及数个变种,已开发为药品者主要为紫锥菊Echiancea purpurea(也称紫松果菊)、狭叶紫锥菊E. angustifolia(松果菊)、和白松果菊(E. pallia), 均是多年生草本^[1-2]。紫锥菊含有菊苣酸、羟基酰胺、多糖、倍半萜、多炔类、咖啡酸衍生物、黄酮等多种活性成分，用以治疗感染、关节炎、肺结核、气管炎、扁桃体炎、湿疹等^[3-5]。菊苣酸是紫锥菊中的主要药用成分，一般用于感冒、牙疼、毒蛇咬伤和其它外伤，它具有抑制透明质酸酶的复制和抗HIV-1（人类免疫缺陷病毒一型）的功效，还防止胶原质受自由基诱导而降解^[4-5]。大量研究表明，紫锥菊可通过刺激机体的免疫系统而增强机体对细菌和病毒感染的抵抗力，具有类抗生素的作用。除供人类临床药用外，该植物还可以作为饲料添加剂应用，以减少抗生素的用量。

二、国内外研究概况

2. 研究的基本内容和问题

一、研究目标：

本项目以紫锥菊的种子为外植体，增殖幼苗，对其分化出来的不定芽用秋水仙素溶液进行诱导。采用形态鉴别、根尖染色体鉴定相结合的方法对获得的种质进行鉴定，为药用紫锥菊优良品种选育创制倍性育种材料提供新途径。

二、研究内容：

3. 研究的方法与方案

研究方法：

1、外植体消毒: 用 75%酒精和0.1%升汞对外植体进行灭菌处理。

将种子用洗衣粉洗净，再用流动的清水冲洗20～30min。然后将种子浸泡在S106抑菌剂中，放置在超净工作台进行灭菌。用75%酒精和0.1%升汞对外植体进行灭菌处理，处理时间分别为20s、4min，20s、5min，20s、6min，无菌水冲洗4～5次，接种到MS培养基上，每瓶接种外植体4-5个。

2、不定芽诱导培养基配方筛选

将用上述方法消毒过的芽接种在含不同激素种类和浓度的MS培养基中，6-BA（6-苄基腺嘌呤）设3个浓度梯度：0.50、1.00、2.00；NAA（萘乙酸）设3个浓度梯度：0.20、0.50、1.00 ；KT（激动素）设3个浓度梯度：0.0、0.5、1.0（浓度单位为mg/L）。可得到9种不同配比的诱导培养基，见研究方法中表1。在每种配比的培养基中接种40个外植体，定期统计各组合出芽早晚、不定芽诱导率和生长状况，筛选最佳不定芽诱导培养基。

表1：不定芽诱导培养基配方筛选

3、同源四倍体离体诱导条件优化

将用上述方法消毒过的芽接种在含不同激素种类和浓度的MS培养基中，6-BA（6-苄基腺嘌呤）设3个浓度梯度：0.50、1.00、2.00；NAA（萘乙酸）设3个浓度梯度：0.20、0.50、1.00 ；KT（激动素）设3个浓度梯度：0.0、0.5、1.0（浓度单位为mg/L）。可得到9种不同配比的诱导培养基，见研究方法中表1。在每种配比的培养基中接种40个外植体，定期统计各组合出芽早晚、不定芽诱导率和生长状况，筛选最佳不定芽诱导培养基。

表2：同源四倍体离体诱导条件优化

4、生根培养基配方筛选

壮苗培养温度为25 ℃ ±2 ℃，光照强度2000 lx ，每天光照时间为12 h，壮苗培养基为MS培养基。幼苗长至3～4cm时，选取生长健壮、长势基本一致的紫锥菊组培苗，每组30个分别接种到生根培养基中进行生根培养，生根培养基为添加不同激素种类和浓度的1/2MS培养基，NAA设4个浓度梯度：0.00、0.10、0.20、0.50；IBA（吲哚丁酸）设4个浓度梯度：0.00、0.10、0.20、0.50（浓度单位为mg/L）。生根培养基配方见研究方法中表3。接种后定期统计各个配方组培苗的生根早晚、生根率、根的条数和粗细程度，筛选出最佳生根培养基配方。

表3：生根培养基配方筛选

5、多倍体鉴定：

（1）株型：植株矮壮的可初步判断为四倍体；

（2）叶色：叶片变大、变厚，叶色浓绿的可判断为四倍体；

（3）气孔观察：植株气孔的长和宽显著大于二倍体且单位面积内气孔密度显著小于二倍体可判断为四倍体；

（4）叶绿体观察：保卫细胞叶绿体数目比未经过秋水仙素处理前明显变多的可判断为四倍体；

（5）根尖染色体鉴定：对照二倍体根尖染色体条数为2n=2x=16，四倍体染色体条数则为2n=4x=32；

（6）流式细胞仪鉴定：对照二倍体DNA相对含量在100处有一个单峰，四倍体植株DNA相对含量在200处有一个单峰，是对照的2倍；

八、技术路线

九、实验方案

1、实验材料

紫锥菊( E．purpurea)的幼苗、种子和植株均由南京农业大学园艺学院的向增旭老师提供。

2、实验方法

（1）种子的消毒处理

将种子用洗衣粉洗净，再用流动的清水冲洗20～30min。然后用滤纸吸干种子上的水，放置在超净工作台进行灭菌。用 75%酒精和0.1%升汞对外植体进行灭菌处理，处理时间分别为20S、4min，20S、5min，20S、6min，无菌水冲洗4～5次，接种到MS培养基上，每瓶接种外植体2-3个。

（2）紫锥菊愈伤组织、不定芽的诱导增殖

将用上述方法消毒过的芽接种在含不同激素种类和浓度的MS培养基中，6-BA（6-苄基腺嘌呤）设3个浓度梯度：0.20、0.50、1.00；NAA（萘乙酸）设3个浓度梯度：0.20、0.50、1.00，见研究方法中表1。在每种配比的培养基中接种30个外植体，定期统计各组合出芽早晚、不定芽诱导率和生长状况，筛选最佳不定芽诱导培养基。

（3）同源四倍体离体诱导与培养

将分化诱导20d的不定芽分别浸泡在浓度为0.025%、0.050%、0.100%秋水仙素溶液中，处理12、24、36、48h，共12个处理，每个处理为40个不定芽，清水浸泡为对照（CK），见研究方法中表2。浸泡后的不定芽用无菌水冲洗3～4次，滤纸吸干水后进行壮苗培养。将诱导过后的紫锥菊植株转移到繁殖培养基中进行继代培养，两代之后进行四倍体鉴定。

（4）同源四倍体鉴定

①形态鉴别：从植株大小、叶色、生长状况等相关的外部特征来初步筛选变异植株。

②根尖染色体鉴定：以紫锥菊组培苗的幼嫩根尖为材料进行常规压片，观察中期分裂像的染色体数目。具体步骤为：待根长至2～3cm时，8︰00～9︰00切取根尖用水洗净，切取刚萌发试管苗根0.5cm左右，在蒸馏水中冲洗3次，放入0.1%秋水仙碱溶液中处理1.5 h，取出后用蒸馏水洗3次，再放入卡诺固定液中固定2h，然后依次用95%与70%乙醇、蒸馏水各洗3次，再用混和酸(45%醋酸，1 mol盐酸、1%硫酸按100:10:1混和)于室温下离析80min，最后水洗3次，放入70%乙醇中保存供镜检。镜检时取根尖2～3条，置于载玻片中央，小心切取根尖0.1cm，加改良苯酚品红染液一滴，0.5 h后盖上盖玻片并轻压轻敲至根尖压成一薄层，用显微镜进行观察并摄影。

十、可行性分析

1、紫锥菊染色体2n=24，在菊科同属植物中染色体比较少，存在很大的加倍空间，是该项目开展的理论可行性；

2、指导老师向增旭课题组多年从事药用植物倍性育种方面的研究工作，先后诱导获得了甜叶菊、铁皮石斛、白术、苍术、桔梗、霍山石斛、白芨等药用植物多倍体种质，在倍性育种方面有多年丰富的经验。实验室具备开展本项目研究的设备、仪器和试剂条件；

4. 研究创新点

1、材料创新：

经过系统CNKI中国知网数据库系统的系统检索，未见关于药用紫锥菊种子为外植体的无菌快繁体系的建立与在其基础上获得同源四倍体种质的报道；

2、技术创新：

5. 研究计划与进展

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