1. 研究目的与意义
一、内容DNA连接酶是1967年在三个实验室同时发现的。
它是一种封闭DNA链上切口酶，借助ATP或NADP水解提供的能量催化DNA链的5'-PO4与另一DNA链的3'-OH生成磷酸二酯键。
但这两条链必须是与同一条互补链配对结合的(T4DNA连接酶除外)，而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA连接酶催化成磷酸二酯键。
2. 文献综述
文献综述：T4 DNA Ligase的纯化及活性检测摘要：DNA连接酶是1967年在三个实验室同时发现的。
它是一种封闭DNA链上切口酶，借助ATP或NADP水解提供的能量催化DNA链的5'-PO4与另一DNA链的3'-OH生成磷酸二酯键。
但这两条链必须是与同一条互补链配对结合的(T4DNA连接酶除外)，而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA连接酶催化成磷酸二酯键。
3. 设计方案和技术路线
方案一：将得到的上清以4ml/min的流速上DEAE柱子（柱子事先用1的PBS，pH为7.5平衡好），上样结束后用Buffer A（1PBS，25mM的NaCl ，pH 7.5）洗涤DEAE柱子，洗涤大约3个柱体积；洗涤结束后用Buffer B（1PBS，300mM的NaCl，pH 7.5）洗脱并收集目的蛋白，将分管收集的目的蛋白跑SDS-PAGE电泳，根据电泳结果将目的蛋白合并。
用Buffer C（1PBS，50mM的NaCl ，pH 7.5）平衡S200柱子。
将合并起来的目的蛋白以2ml / min的流速上S200柱子。
4. 工作计划
第一阶段：2022年1月查阅T4 DNA连接酶的化学结构及其纯化方法相关文献，明确活性研究方向。
第二阶段：2022年2月 根据文献提示和指导老师的指导，完成实验路线的设计，整理实验综述。
第三阶段：2022年3-4月在已搜集到的资料的基础上完成开题报告，并根据实验路线开始实验。
5. 难点与创新点
方法重复性好，稳定性高。
