1. 研究目的与意义
本课题主要研究内容包括为：①纯度检查；②生物学活性测定。其中质量研究中常规项目的研究方法参照《中国药典》2015年版3部附录收载的方法进行，并结合样品的特性选择具体的方法
意义：本课题依托于国家科技重大专项课题--重大新药创制专项常州千红国际生物医药创新药物孵化基地项目，按照国家一类生物制品的要求，开展靶向性抗肿瘤新药RGD- TRAIL 的临床前研究中的质量研究部分，建立一类生物制品的原液和制剂质量标准，为新药报批准备资料，并最终创制一种具有安全、有效、特异性高的新型肿瘤治疗药物，从而解决提高恶性肿瘤疗效、改善肿瘤病人的预后，提高用药的安全性。本课题目前已经完成临床前研究的部分工作，种子库和纯化小试工艺已经确定，迫切需要建立质量标准和质控方法。本研究对大肠杆菌原核系统表达的RGD-TRAIL原液与制剂进行质量研究。参照《中华人民共和国药典》2015年版第三部和《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》的有关要求，建立有关产品的纯度和生物学活性等方面的质量标准及检定方法。
2. 文献综述
TRAIL的研究进展
【摘要】肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体（TRAIL）是肿瘤坏死因子超家族的一个新成员，因其表现出优先诱导恶性肿瘤细胞凋亡的特性，使其成为一个有潜力的肿瘤治疗候选药物。本文介绍了近年来TRAIL在结构、凋亡诱导机制和临床应用等方面的研究进展。
【关键词】TRAIL、细胞凋亡、死亡受体、诱骗受体
[Abstract]Tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand (TRAIL) is a new member of the tumor necrosis factor superfamily, because of its performance is preferentially induces apoptosis of malignant cells, making it a potential candidate drugs for the treatment of tumor. This paper introduces recent research progress of TRAIL induced by the clinical application and mechanism in the aspects of structure, apoptosis.
[Kry words] TRAIL、apoptosis、death receptor、decoy receptor
生物技术被认为是21世纪最具主导地位的高新技术，生物技术药物也成为当前药物研发的活跃领域。生物技术的快速发展使得人类在疾病的预防、诊断和治疗方面取得空前的进步。目前生物制药主要应用于肿瘤、神经退化性疾病、自身免疫性疾病、冠心病和银屑病等疾病的治疗，并在肿瘤治疗领域尤为突出。自上世纪90年代以来，全球生物药品的销售额以每年平均30%的速度增长，大大超过了全球医药行业年均不到10%的增长速度[]。而其中抗肿瘤药自从2007年超越降血脂药后，一直处于全球医药市场领头羊的位置，2012年的销售额已超过了700亿美元[]。
蛋白质类抗肿瘤药物具有高效低毒，且能够有效避免放疗化疗的副作用的优点，因此一直以来都是抗肿瘤治疗的研究重点，其中通过基因工程技术构建融合蛋白，靶向治疗肿瘤，更是近年来抗肿瘤的研究热点。目前应用于临床肿瘤治疗的蛋白质类药物主要有干扰素、白介素等，虽然在临床治疗上已成功的治疗了某些特定来源的肿瘤，但是从总体上来说临床疗效一般，同时也产生了严重的毒副作用和剂量依赖性，并且只对部分病人敏感。因此研究开发具有更好临床效果和更小毒副作用的蛋白质药物是很有必要的。本文就近年来几种研究热点中的TRAIL蛋白在肿瘤治疗中的应用及研究进展做一综述。
作为抗癌药物，TNF配体表现出强大的潜力，因为它不仅可以直接作用于肿瘤细胞或肿瘤脉络系统，还可以促进诱导肿瘤免疫应答。然而由于其缺乏肿瘤选择性，可引起严重的副作用 ，使TNF配体的临床应用受到极大的限制。而1995年Wiley等人发现的肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体（TNF-related apoptosis inducing ligand，TRAIL）作为TNF超家族的新成员，其对多种肿瘤细胞和转化细胞表现出极高的敏感性，而对正常细胞则无凋亡诱导作用。
1.TRAIL蛋白结构
肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体（TRAIL）是Wiley等[]人于1995年检索EST时首次发现的，并将其成功克隆出来，它是TNF超家族的新成员，与TNF-α，FasL等有较高的同源性。随后，Pitti等[]进行研究进一步证实，并将其命名为Apo-2L（Apoptosis-2 Ligand）。TRAIL基因定位于染色体3q26.1-26.2，为1769bp片段，包含有5个外显子，cDNA全长1050bp，编码由281个氨基酸组成的Ⅱ型跨膜蛋白，该蛋白相对分子质量为32.5kD，等电点为7.63[]。TRAIL蛋白N末端14个氨基酸位于细胞胞浆内，无信号肽；15~40位氨基酸构成跨膜区域；C端位于细胞膜外，包括40~281位氨基酸，该区域的氨基酸序列保守性较强，形成几个β折叠结构，在形成典型的β链夹心，即同源三聚体结构。人和鼠的TRAIL分别由281和291个氨基酸组成，具有65%的同源性[]。将TRAIL的C末端的氨基酸序列和其它的TNF家族成员进行比较，结果显示二者具有较高的同源性，其同源性为Fas（Apo-1L）23%、CD40L20.8%、TLα20.2%、LTβ19.6%、TNF10%、CD30L、CD27L各15.5%、OX40L14.3%[]。TRAIL的胞外区域含有蛋白酶酶切位点，在蛋白酶的作用下，可将细胞外部分降解，形成可溶性分子sTRAIL。目前尚无文献证明人体内形成sTRAIL，仅见重组sTRAIL胞外片段融合蛋白的报道。
TRAIL蛋白的109位天冬氨酸残基是一个潜在的N-糖基化位点，可被金属蛋白酶切割，产生114~281氨基酸残基的胞外活性部位，但是邻近的脯氨酸会阻碍其糖基化。在近氨基末端裂点处，137~152位氨基酸可形成一个由12~16个氨基酸残基组成的拉长AA环[]，该环对TRAIL蛋白发挥细胞毒性和与受体结合都起到重要作用。
TRAIL分子在230位又一个不配对的半胱氨酸（Cys230）（如图1），它可以与锌离子螯合，形成典型的β链夹心三聚体结构，该三聚体结构是TRAIL蛋白最强的生物活性构型[]。当Cys230发生突变时，则不能形成三聚体，使其与受体结合的能力降低约200倍，进而导致其诱导肿瘤细胞凋亡的能力降低，使生物活性减弱。因此，Cys230是TRAIL分子的重要功能基团，对维持TRAIL的空间结构和生物学活性具有决定性作用。
Figure 1：The Apo-2L/TRAIL zinc binding site
TRAIL主要在胎肝、胎肺、胎肾、和成年人脾脏、淋巴结、肾脏、胸腺、前列腺、卵巢、小肠、结肠、心脏、骨骼肌、外周淋巴细胞等组织中表达[]，但在脑、肝脏和睾丸中未发现TRAIL转录因子。此外多种刺激因子可诱导TRAIL蛋白的转录表达[]。更有研究表明，淋巴细胞中的NF-κB是控制TRAIL转录表达的关进因素[]。此外，TRAIL的表达还存在着其它调控路径。有实验发现，采用Ⅰ型干扰素（IL-Ⅰ）刺激外周血T细胞和树突细胞后，发现TRAIL的表达上调[]。
2.TRAIL受体结构及其功能
TRAIL是通过与其受体结合后而发挥生物活性的。迄今为止，共发现5种TRAIL受体分子[]（图2），分别是TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRAIL-R3、TRAIL-R4、破骨素（Osteoprotegrin）。
Figure 2:The structure of TRAIL receptors
2.1.死亡受体
TRAIL的死亡受体主要包括以下两种，TRAIL-R1（DR4）和TRAIL-R2（DR5、TRICK 2（TRAIL receptor inducer of cell killing 2）），而这基因均定位于8p21-22。DR4和DR5在结构上均为典型的Ⅰ型跨膜蛋白，胞外区域含有2~5个半胱氨酸富集区域（CRD），胞内则有死亡功能区（Death domain，DD）。受体在与TRAIL特异性结合后，DD与Fas相关蛋白的死亡结构域（Fas-associated death domain，FADD）结合激发凋亡信号传导，导致细胞死亡。
但二者又各有特色。DR4广泛分布于各种组织，受TFN-γ刺激后其表达水平上升；DR5则主要分布于外周血淋巴细胞和骨骼肌细胞中，其表达受阿霉素、TNF-α和一些DNA损伤剂的调节。DR4可以通过不同信号通路激活NF-κB和JNK，NF-κB的激活可以抵抗凋亡，但其激活作用较为微弱，不足以使肿瘤细胞逃避死亡的命运[]。DR5则可以以组织特异性的方式激活NF-κB。
2.2.诱骗受体
目前发现的TRAIL诱骗受体有两种，分别是TRAIL-R3（DcR1、TRID（TRAIL receptor without an intracellular domain））和TRAIL-R4（DcR2、TRUNDD（TRAIL receptor without a truncated death domain））。二者的基因也定位于8p21-22，与死亡受体的胞外区具有较高的同源性，也含有2个半胱氨酸富集区域（CRD），可以与TRAIL结合。诱骗受体与死亡受体最主要的区别在于，DcR1没有胞内区，它可以与糖磷脂（GPI）共价结合，形成蛋白质-糖-脂肪酸复合物，锚定在细胞膜表面上；DcR2有胞内区，但不完成，呈现出无功能的截断状态。因此，DrR1和DrR2可以与TRAIL结合，但不能传到死亡信号。当组织中同时表达死亡受体和诱骗受体时，DrR1和DrR2就可以竞争性抑制TRAIL与死亡受体的结合，使细胞逃离死亡的命运。
2.3.破骨素
1998年Emery等[]人发现了TRAIL的第5个受体，并将其命名为OPG（破骨素，Osteoprotegerin），是一种分泌型的TNF受体，为可溶性蛋白，在体内具有抑制破骨和增加骨密度的作用。同时近年来研究表明，OPG受体通过与TRAIL结合，竞争性抑制Jurkat细胞中TRAIL介导细胞凋亡的作用。同时，OPG通过它的OPG配体来调节破骨细胞的分化和活化，达到调节骨吸收的作用，而当TRAIL与OPG受体结合后，TRAIL则封闭了OPG抑制破骨的作用。可见TRAIL和OPG在体内是互相调节的[]。而至于OPG在细胞凋亡中的其它作用目前尚不十分明确。5种受体的详细对比具体内容见表[]1。
Tab1 TRAIL Receptors
受体 | TRAIL-R1 | TRAIL-R2 | TRAIL-R3 | TRAIL-R4 | Osteoprotegrin |
别名 | DR4 | DR5/TRICK2/KILLER | DcR1/TRID/LIT | DcR2/TRUNDD | OPG |
氨基酸 | 468 | 411 | 259 | 386 | / |
功能 | 死亡受体 | 死亡受体 | 诱骗受体 | 诱骗受体 | 诱骗受体 |
死亡区域 | 是 | 是 | 否 | 是（典型死亡区域的1/3） | 否 |
高表达器官 | 外周血白细胞，脾 | 胎肝、卵巢、肝、脾、肺 | 外周血淋巴细胞、脾、肺、胎盘 | / | / |
CRDs | 2 | 2 | 2 | 2 | |
特征 | GPI锚定 | 可溶 | |||
NFκB激活 | 是 | 是 | 否 | 是 | / |
基因所在染色体 | 8p21-22 | 8p21-22 | 8p21-22 | 8p21-22 | 8p23-24 |
亲和力 | 高 | 高 | 高 | 高 | 低 |
3.TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡机制
研究表明，TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡的信号传导途径主要有以下几种：死亡受体介导的凋亡路径、转录因子调控的凋亡通路和线粒体路径。而正常细胞则可以通过其它多种机制来逃避TRAIL诱导的凋亡作用。
3.1.死亡受体介导的凋亡路径
死亡受体介导的凋亡路径如图3所示。
Figure 3:The signaling pathway of apoptosis inducement by TRAIL
该过程主要分为以下几个步骤：
首先，死亡受体DR4或DR5的胞外区域先于TRAIL结合，使胞内的DD相互聚集，并与接头蛋白（adaptor）结合，进而诱使胞浆内的胱天蛋白酶（caspases）级联反应的发生。接头蛋白一端与DR4或DR5的DD相连，另一端含有死亡效应结构域（death effector domain，DED）。当接头蛋白与死亡受体结合后，接收到凋亡信号，使胞浆内的半光蛋白酶原（pro-caspases-8）在其末端局部募集和串联结合，从而形成DR4/DR5-接头蛋白-pro-caspases-8大分子复合物，即死亡诱导信号复合物，促使pro-caspases-8自我催化成有活性的caspases-8。
第二，caspases-8活化后，通常有两条路径传递凋亡信号。在Ⅰ型细胞中经线粒体非依赖型路径，即活化的caspases-8进一步激活下游的酶原caspases-3/-6/-7，然后形成有活性的caspases-3/-6/-7执行凋亡程序。而在Ⅱ型细胞中，caspases-8激活不足或不充分，则需要借助于细胞自身固有的凋亡途径。caspases-8催化Bid（Bcl-2家族促凋亡蛋白）分裂为激活状态的tBid，tBid的C末端作用于线粒体上，引起线粒体跨膜电位降低，促使线粒体释放细胞色素C（Cyt C），进而启动线粒体依赖性凋亡途径[]。
3.2.转录因子调控的凋亡通路
除以上路径外，TRAIL与死亡受体结合后，还可以激活NF-κB和JNK（NH2-terminalKinase）通路。与TNFα和其它细胞毒药物相似，TRAIL也可以激活NF-κB，而NF-κB的活化可以拮抗细胞凋亡过程，可能与抗凋亡分子的表达有关。Bernard等[]发现，NF-κB的活化诱导DcR1表达上调，竞争性保护细胞逃逸凋亡。然而Ravi等[]却研究发现NF-κB的C-Rel亚基还可以诱导死亡受体DR4/DR5表达，通过上调TRAIL和受体，活化TRAIL的凋亡级联反应。
NF-κB作为一个多向因子，可能是细胞凋亡、增值和转化的关键因素。目前TRAIL激活NF-κB的机制尚不十分明确，是否依赖FADD也有待进一步研究。
3.3.正常细胞逃逸TRAIL杀伤的机制
TRAIL在多数组织中具有表达，这就暗示着正常细胞存在着避免其细胞毒性的保护机制。有研究表明，DcR1的mRNA在正常细胞中优先形成，并且DcR2也有激活NF-κB的能力，因此，假设诱骗受体通过竞争性抑制TRAIL而使正常细胞逃逸TRAIL的凋亡作用。但是又有很多实验证实正常细胞抵抗TRAIL作用并非完全依赖于诱骗受体。Mitsiades等[]证实，黑色素瘤和乳腺腺癌细胞中有诱骗受体mRNA和蛋白质存在；在甲状腺癌细胞中也发现了DcR1和DcR2。Griffith等[]还证实，黑色素瘤细胞中诱骗受体的表达并不影响肿瘤细胞对TRAIL的敏感度。随着研究的深入，对解释该现象提出了新的假说。Zhang X D[]发现，纤维原细胞在逃逸TRAIL杀伤时，其关键作用的是表面死亡受体的不表达或低表达，以及下游caspases-3凋亡抑制剂的作用。因此提出新假说，诱骗受体可能并不是正常细胞对抗TRAIL杀伤的唯一机制，可能存在着其它的调节机制。
4.TRAIL在肿瘤治疗方面的应用
TRAIL因其独特的选择性诱导肿瘤细胞凋亡而对正常细胞无毒性的特性，有望成为肿瘤治疗药物。Pitti等进行的体外实验结果表明，TRAIL对肿瘤细胞，如Hela宫颈癌细胞、A549肺癌细胞等，呈现特异性的杀伤作用，对正常人外周血淋巴细胞无毒性作用；并且Gazite等还证明，此种杀伤作用呈时间和剂量依赖性。体内初步药效学研究表明，TRAIL可以抑制人肺癌细胞在小鼠体内的生长，但对小鼠的正常细胞无影响；Arai等[]研究发现，对荷瘤小鼠应用重组TRAIL后，肿瘤细胞的生长得到明显的抑制，甚至于肿瘤组织出现消退，但对宿主细胞则无明显伤害。Ashkenazi和Pan等[]采用重组TRAIL治疗动物体内肿瘤，实验也取得令人鼓舞的结果。
除以上临床前研究报道，近年来国外也陆续出现TRAIL应用于临床肿瘤治疗的报道，而我国则在2005年首次批准重组人TRAIL进入临床研究阶段。Lin等[]对27癌症患者应用大肠杆菌表达的重组TRAIL，Ⅰ期临床结果初步证实了TRAIL的有效性和安全性，同时还发现患者是否存在肝功能严重异常对TRAIL蛋白的药代动力学无明显影响。
同时，TRAIL还可以与一些化疗药物进行协同治疗。Nagane等[]研究发现，顺铂（CDDP）和足叶乙苷（VP-16）能够上调胶质瘤细胞的DR5水平，因此当TRAIL和DNA损伤化疗药物联合用药时，可加速肿瘤细胞的凋亡。此外，还发现有些肿瘤细胞对TRAIL不敏感，但在某些药物细胞因子，如白介素2（IL-2），的作用下可使其变得对TRAIL敏感。同样的，TRAIL也可以逆转部分肿瘤细胞对化疗药物的耐药性。二者联用不仅减少了药物单独使用时的毒副作用，而且增强了疗效，具有良好的临床应用前景。
但是近年来也有一些报道陆续指出TRAIL并非对正常组织细胞完全没有伤害。Jo M的研究组指出，TRAIL能够诱导人正常肝细胞凋亡，但是Lawence等[]采用临床级重组TRAIL进行研究，没有得出与之一致的结论。也有研究指出，TRAIL因其的肝毒性因物种而异，Mariani等[]指出，TRAIL对人肝细胞有损伤作用，但却不能引起大鼠、小鼠、恒河猴肝细胞的凋亡。Siomon等[]研究还发现不同的细胞类型对TRAIL也表现出不一样的敏感性。因此，在应用TRAIL进行肿瘤治疗时仍需慎重。
5.展望
TRAIL自从被发现以来，就引起了研究者的广泛关注，纷纷对其结构、作用机制和应用等方面进行深入的探讨和研究。TRAIL特异性诱导肿瘤细胞凋亡而对正常细胞无毒性的独特优势，使其很快向成为新型抗肿瘤药物的方向发展。研究者分别提出以下三条肿瘤治疗的发展方向：
（1）利用生物导弹运载到靶位治疗肿瘤。
（2）构建腺病毒载体将TRAIL基因导入到肿瘤细胞，是肿瘤细胞中TRAIL高度表达，从而诱导肿瘤细胞凋亡。Jacob等[]研究发现，将TRAIL基因导入到含有精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸（RGD）序列的腺病毒载体中，能够克服细胞对TRAIL的耐药性，它们用端粒酶启动子在纤维修饰的腺病毒载体中表达TRAIL-F，将其注射到携带有原位胰腺癌小鼠模型的胰尾部后，发现用药组比对照组的肿瘤体积小8倍。
（3）与化疗药物联合应用。Maccon等[]指出，当阿霉素，5-氟尿嘧啶与TRAIL联合应用时，可显著提高TRAIL的诱导凋亡的作用。
但是TRAIL研究至今，仍有很多问题尚须解决，例如其信号传导途径有待进一步明确；TRAIL是否存在新的生物学活性；正常细胞对抗TRAIL作用的机制，总之，还有许多未知的领域等待着人们去探索去研究，对TRAIL的进一步探索研究将是未来一段时间许多科研工作者的一个有意义的科研课题。
3. 设计方案和技术路线
1、纯度检查包括
电泳法（还原性、非还原性SDS-PAGE法等），液相色谱法（常用分子筛、反相、离子交换层析等），LC-MS连用等。根据不同方法的特点，所具备的实验条件及样品特性等，选择合适的方法进行研究。
2、生物学活性测定
4. 工作计划
本课题预计持续时间约为13个月
起止日期 | 工作内容和要求 |
2022.1-2022.2 | 纯度检测方法摸索 |
2022.1-2022.2 | 纯度检测方法验证 |
2022.2-2022.3 | 生物活性检测方法摸索 |
2022.3-2022.4 | 生物活性检测方法验证 |
5. 难点与创新点
本课题依托于国家科技重大专项课题--重大新药创制专项常州千红国际生物医药创新药物孵化基地项目，按照国家一类生物制品的要求，开展靶向性抗肿瘤新药RGD- TRAIL 的临床前研究中的质量研究部分，建立一类生物制品的原液和制剂质量标准，为新药报批准备资料，并最终创制一种具有安全、有效、特异性高的新型肿瘤治疗药物，从而解决提高恶性肿瘤疗效、改善肿瘤病人的预后，提高用药的安全性。本课题目前已经完成临床前研究的部分工作，种子库和纯化小试工艺已经确定，迫切需要建立质量标准和质控方法。本研究对大肠杆菌原核系统表达的RGD-TRAIL原液与制剂进行质量研究。参照《中华人民共和国药典》2015年版第三部和《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》的有关要求，建立有关产品的纯度和生物学活性等方面的质量标准及检定方法。
