1. 研究目的与意义
PeperominE是从胡椒科草胡椒属抗癌中药石蝉草（PeperomiadindygulensisMiq.）全草中分离得到的具有二芳基乙烯基丁内酯母核的天然裂木脂素化合物，其化学结构如下图：
本实验室前期研究发现PeperominE有较好的体内、体外抗肿瘤活性。其中对胃癌、肺癌及急性髓性白血病的抗肿瘤效果最好。由于该天然产物抗肿瘤作用的靶标及通路尚不明确，影响了其进一步的研究与开发。为了筛选PeperominE抗肿瘤的靶标，实验室前期通过反向分子对接实验，发现该化合物与DNA甲基化酶有较强的结合能力。在此基础之上，我们发现PeperominE能有效的降低肿瘤细胞的DNA甲基化水平，使肿瘤抑制因子RASSF1A去甲基化，增加其在体内的表达，从而激活MST1,CNK1以及MOAP1凋亡通路，最终导致肿瘤细胞的凋亡。
2. 文献综述
石蝉草化学成分及药理作用研究进展
徐晶晶
摘要：本文对石蝉草的化学成分及药理作用进行综述。通过对近年来有关石蝉草及胡椒科草胡椒属研究的文献进行了检索和综述，总结了石蝉草的化学成分及相应的生物活性。其中一些特殊物质，如断联木脂素类化合物，对该类化合物在抗肿瘤、抗艾滋病病毒等方面的生物活性进行介绍，为后续测定PeperominE抗肿瘤活性提供理论依据。
3. 设计方案和技术路线
研究方案 1.LC-MS/MS检测DNA甲基化酶活性的方法学研究 （1）反应酶的制备 选用细胞核内DNMT高表达的肿瘤细胞（肺癌细胞A549、人急性白血病细胞HL-60、MOLT-4），使用试剂盒提取核蛋白，Bradford法测定蛋白的含量后，分装，-80℃保存。 （2）S-adenosylhomocysteine（SAH）含量测定方法的建立 SAH为细胞核内DNA甲基化转移酶对内源性S-adenosylmethionine去甲基化的产物，通过对该物质的定量，可以直接反应DNA甲基化酶的活性。实验采用ProminenceUFLC液相系统（Shimadzu）联合5500-Q-Trap三重四级杆（AppliedBiosystem公司）质谱系统对SAH含量进行检测，建立在DNA甲基化酶及反应缓冲液条件存在条件下，SAH含量测定的方法，包括灵敏度、重现性、稳定性以及基质效应。 （3）基于LC-MS/MS法检测DNA甲基化酶的活性及酶动力学特性 a.DNA甲基化酶的反应条件 1)底物浓度（底物：5μgDNMT） 2)pH及温度（pH7.4，37℃） 3)反应时间（90min） 4)抑制剂种类(Decitabine，5-aza-2-deoxycytodine) b.DNA甲基化酶活性的检测 基质SAM与底物DNMT在上述反应条件下进行酶促反应，抑制剂（Decitabine）作用于DNMT，LC-MS/MS法测定SAH的生成量，酶活性以单位时间下产物生成量即酶活力单位U表示。 c.基于LC-MS/MS法检测DNA甲基化酶酶动力学特征 固定酶浓度(2μg/ml)，与浓度在0.1-40μg/ml的SAM在37℃下反应90min后，以LC-MS/MS法测定SAH的生成量，做出SAH(Y)-SAM(X)曲线，即DNMT酶动力曲线，斜率K即反应速率，得Km。 2.基于LC-MS/MS技术检测PeperominE对DNA甲基化酶活性的影响 基质SAM与底物DNMT在上述反应条件下进行酶促反应，天然产物中提取所得的酶抑制剂PeperominE作用于DNMT，LC-MS/MS法测定SAH的生成量，单位时间下产物生成量即酶活力单位U。与不加抑制剂的空白组的酶活对比，即可得出结论。 |
研究技术路线 |
4. 工作计划
2022.3-2022.4进入实验室熟悉常规实验流程；
制定实验方案，撰写开题报告；实验前期条件考察
2022.4-2022.5按照既定实验方案进行实验
5. 难点与创新点
目前DNA甲基化酶活性的检测方法主要是基于抗原抗体反应的原理，该法灵敏度低，重现性差且成本较高，且目前没有相应的替代方法。为了解决以上问题，本课题研究建立液质联用方法的高灵敏快速检测DNA甲基化酶活性的技术，并基于该项技术检测PeperominE对DNA甲基化酶活性的影响。为今后小分子DNA甲基化酶抑制剂的高通量筛选提供快速、稳定、灵敏的方法；进一步阐明PeperominE抗肿瘤活性的机制，为该化合物进一步的研究与开发提供理论依据。
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