1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
1973年Steinman和Cohn[1]首次从小鼠脾组织中分离发现分离出一类与粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞不同，形态、功能均极为特殊的免疫细胞,命名为树突状细胞(Dendritic cell, DC)。此后DC逐渐成为人们研究的热点，获得一定量有功能的DC是深入研究其生物学功能的前提和关键。但DC作为一种微量细胞，在体内分布散在，在动物和人外周血中尚不足白细胞总量的1。分离及纯化比较困难，这妨碍了对其形态、结构及功能进一步研究。
自从Inaba等于1992年首用重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (granulocyte -macrophage colony-stimulating-fact，GM-CSF)从小鼠骨髓中大规模培养制备 DC 的方法[2]后，DC的功能才逐步被发现。机体内的DC大部分处于非成熟状态，具有极强的内吞功能，抗原被DC摄取后，经过MHCⅡ类分子的处理、加工，形成抗原多肽。虽然DC在体内含量甚微,仅占外周单个核细胞的0.1～0.5，但其分布广泛，抗原提呈能力是巨噬细胞的10～100倍[3]。DC不仅是目前已知功能最强的抗原呈递细胞，也是唯一能启动初始T细胞和B细胞的一类细胞，它在机体抗肿瘤、抗感染、移植排斥及自身免疫性疾病的预防与治疗中发挥着重要作用[4]。
我们一般将具有典型树突状形态且膜表面高表达MHCⅡ类分子，能迁移至淋巴器官，可刺激初始型T细胞增殖活化，具有一些相对特异性表面标志的一类细胞称为DC[5]。DC并不是一个均一的群体，但所有的DC均来源于骨髓干细胞，不论是组织DC还是培养DC，不论是人DC还是小鼠DC，均可区分为非成熟和成熟两个阶段[6]。未成熟的DC的主要特征为细胞表面突起较短,细胞表面低水平表达MHC-Ⅱ类分子和共刺激分子CD80、CD86等，具有较强的抗原捕获和处理能力，但刺激混合淋巴细胞反应的能力较弱。成熟DC主要特征为细胞表面有大量细长突起且有分支；细胞表面高表达MHC-Ⅱ类分子和共刺激分子CD80、CD86等[7]。
2. 研究的基本内容和问题
研究目标：
本试验旨在用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素 (Interleukin, IL-4) 诱导小鼠骨髓前体细胞分化为树突状细胞，建立一种体外诱导培养小鼠髓源树突状细胞的方法。通过形态学观察、细胞表型分析，对小鼠髓源树突状细胞的体外诱导培养进行鉴定,以后培养特定成熟状态的DC奠定一定的基础。
研究内容：
3. 研究的方法与方案
研究方法、技术路线、实验方案：
1. 小鼠骨髓来源树突状细胞的培养 参照研究内容部分可制备得到
2．流式细胞分析仪检测小鼠髓源树突状细胞的表型
①用5ml移液管轻轻吹打六孔细胞培养板底部，然后收集细胞液于两支离心管，用1000r/min的速度离心5min后弃去上清，共洗两次。
②弃掉上清，用PBS重悬细胞后进行细胞计数，计算细胞总数后加入适当量的PBS重悬细胞使细胞浓度达到105-8个/0.2mL。
③取八个高压过的1.5mL EP管，分别吸取100uL上述细胞悬液加入到八个1.5mL EP管中，接着避光操作按下表的计量加入单抗后用200uL移液枪将单抗和细胞混匀，做好各个管的标记并室温避光孵育30min。
表1 单抗加入量
抗体 | 使用量（uL） | 同型抗体 | 使用量（uL） |
CD11c | 1.8 | IgG | 1.8 |
CD80 | 0.3 | IgG | 0.3 |
MHC-Ⅱ | 0.1 | IgG 2b | 0.1 |
④用1000uL移液枪分别向每管加入PBS缓冲液1mL，轻轻吹打混匀后以1000r/min的速度离心5分钟，重复洗涤三次彻底洗掉未结合的抗体。
⑤弃掉上清，每管加入400ul PBS配制的4的多聚甲醛并轻轻吹打混匀后将其放入避光盒，4℃避光保存，24h内上流式细胞仪检测
可行性分析：
1．本实验前已有一定的研究基础，实验所需试剂所在课题组也已经制备好。
2．国外有一些相关文献的报道可为实验提供一定的理论基础。
3．本实验关键问题之一，小鼠树突状细胞的培养虽然比较难但是所在实验室有一定的培养经验。
4．该实验的实验方案步骤清晰、可行，所有仪器，试剂及其他条件均已具备，为实验提供了可靠地保障。
4. 研究创新点
DC作为一种微量细胞，在体内分布散在，在动物和人外周血中尚不足白细胞总量的1。分离及纯化比较困难，这妨碍了对其形态、结构及功能进一步研究。本实验改进了Inaba 等的培养方法，除了加入GMCSF外还加入了白细胞介素 (interleukin,IL-4)。IL-4能抑制培养体系中的中性粒细胞和巨噬细胞的产生，得到较高纯度的DC。将形态学特征结合流式细胞术测定DC表面成熟标志及协同刺激分子的表达鉴定DC及其成熟状态为以后培养特定成熟状态的DC奠定一定的基础。
5. 研究计划与进展
1. 购买实验动物以及配制实验试剂。
2. 预实验培养验小鼠骨髓来源树突状细胞，改进培养方法。
3. 培养小鼠骨髓来源树突状细胞并进行光学显微镜观察和流式细胞术分析鉴定DC及其成熟状态。
