1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
1国内外研究概况
鸭病毒性肝炎（Duck viral hepatitis, DVH）是鸭肝炎病毒（Duck hepatitis virus, DHV）感染引起的一种传播迅速、高发病率急性、接触性和高度致死性传染病，也是一种理想的人类肝炎研究疾病模型。随着养鸭业不断向产业化、集约化和规模化方向发展，DVH的危害日趋严重，临床上一旦发病，因缺乏有效的药物治疗而造成大批死亡，对今后DVH的综合防控提出了新的挑战。
鸭病毒性肝炎其特点是发病急、病程短、传播快、病死率高等，可引起21日龄以下的雏鸭发生急性肝炎，有的可能腹泻，成年鸭可感染但不发病。其临床特征为患鸭在临死时常常发生痉挛，头向背部后仰，呈角弓反张的特异姿势，俗称背脖病。DVH自然爆发时仅发生于雏鸭，且主要为21日龄以内的雏鸭，以4-8日龄雏鸭最易感染，成年鸭呈隐性感染，无临诊症状，但能排毒。雏鸭的发病率为20% -100%[1-2]。
2. 研究的基本内容和问题
研究的目标
本试验研究目标是筛选出具有抗DVH的中药成分复方，为研制抗DVH的新药奠定基础。
内容
3. 研究的方法与方案
1 抗DHAV单味中药成分的筛选
1.1 鸭胚肝细胞（duck embryonic hepatocytes, DEHs）单层制备
取14日龄鸭胚，用75%乙醇消毒蛋壳气室，打开，无菌取出鸭胚，置于培养皿，打开腹腔，取出肝脏，去除胆囊，用D-Hanks液洗去血液，捣碎，D-Hanks液洗涤3次至澄清；加入0.2%胰蛋白酶5ml，转移至50ml烧杯，置38.5℃消化5min，加入10% DMEM停止消化，再用D-Hanks液洗涤3次；加入10% DMEM 用粗口吸管吹打，吸取细胞悬液，重复多次收集；合并细胞悬液，4层纱布过滤，细胞计数调成5105个/mL，加入96孔板，置CO2培养箱37℃培养。等细胞长成单层后，弃去营养液，用D-Hanks 洗3遍，用于安全浓度测定或体外筛选。
1.2 单味药物对DEHs安全浓度的测定
将倍比稀释的不同浓度的中药成分用细胞维持液稀释，分别DEHs单层中，每孔100μL，每个浓度重复6孔；同时设不加药液的细胞对照孔（Cell Control, BC）。细胞板放入37℃ ，5% CO2培养箱继续培养72 h ，MTT法[[i]]测定A570值。。选择A570值不显着低于CC组的药物的最大浓度作为该药物的最大安全浓度。
1.3 单味药物抗DHAV感染DEHs的筛选
根据各种单味药物对DEHs的安全浓度的测定结果，分别将各中药成分用细胞维持液自2倍最大安全浓度起倍比稀释5个浓度梯度，按如下方式分别加入到DEHs中：Ⅰ)先加药物后接种病毒：每孔加入不同浓度的药液50μL，培养2h后再各加入100 TCID50 DHAV 50μL；Ⅱ)先接种病毒后加药物：将100 TCID50 DHAV 50μL加入到细胞单层中，培养2h后加入各浓度药液，每孔50μL。以上每种药物各浓度均重复5孔，为各试验孔（Testhole, T）；同时设立只加细胞维持液的细胞对照孔(Cell Control, BC) 、只加病毒液的病毒对照孔(Virus Control, VC)和只加药物的药物对照孔（Medicine Control, MC），以上各孔均用细胞维持液调整使其培养液体积与试验孔一致。之后将培养板置37℃,5% CO2培养箱继续培养72-108h，待病毒对照出现75%病变时，MTT法测定A570值。
中药成分抗DHAV感染DEHs的作用除直接以A570值比较外，还以病毒抑制率比较。病毒抑制率=（ T VC）/（ CC VC）100%。
2 抗DHAV中药成分复方的筛选
2.1 复方对DEHs安全浓度的测定
将倍比稀释的不同浓度的中药成分用细胞维持液稀释，分别DEHs单层中，每孔100μL，每个浓度重复6孔；同时设不加药液的细胞对照孔（Cell Control, BC）。细胞板放入37℃ ，5% CO2培养箱继续培养72 h ，MTT法测定A570值。。选择A570值不显着低于CC组的药物的最大浓度作为该药物的最大安全浓度。
2.2 复方抗DHAV感染DEHs的筛选
根据各种单味药物对DEHs的安全浓度的测定结果，分别将7种中药成分用细胞维持液自2倍最大安全浓度起倍比稀释5个浓度梯度，按如下方式分别加入到DEHs中：
Ⅰ)先加药物后接种病毒：每孔加入不同浓度的药液50μL，培养2h后再各加入100 TCID50 DHAV 50μL；Ⅱ)先接种病毒后加药物：将100 TCID50 DHAV 50μL加入到细胞单层中，培养2h后加入各浓度药液，每孔50μL。以上各孔均用细胞维持液调整使其培养液体积与试验孔一致。之后将培养板置37℃,5% CO2培养箱继续培养72-108h，待病毒对照出现75%病变时，MTT法测定A570值。
中药成分抗病毒感染细胞的作用除直接以A570值比较外，还以病毒抑制率比较。病毒抑制率=（ T VC）/（ CC VC）100%。
2.3 抗DVH中药成分复方体内筛选
将2.2筛选出的中药成分复方分别作为复方药物治疗组，以DHAV攻毒1周龄以内雏鸭，同时设攻毒对照和空白对照（隔离饲养）。复方药物治疗组每组用于攻毒后饮水给药，用药前控制饮水；自由采食。
观察记录攻毒后观察各组鸭的临床症状和病理变化，每天定时观察记录各组鸭临床症状及发病死亡情况，直至停止死亡后24小时。死亡鸭逐只剖检观察病变，以具有典型鸭病毒性肝炎病变记录为有效。
技术路线
DEHs培养 |
单药成分安全浓度测定 |
单药成分抗病毒浓度测定 |
筛选出有效抗DHAV的单药成分 |
中药成分复方安全浓度测定 |
中药成分复方体外抗DHAV筛选 |
筛选出体外有效中药成分复方进行体内抗DHAV |
筛选出体内抗DHAV效果好的中药成分复方 |
可行性分析
理论分析：中药成分具有抗病毒作用，中药成分复方抗病毒也有成果，具有一定的理论基础。实验方法方面：CEHs培养方面技术已经成熟，有技术保证。实验设备方面：中兽医实验室有相关的设备、仪器、动物房，完全可以使实验顺利进行。
4. 研究创新点
特色或创新之处
中药复方的分的复杂性导致质量的可控性较差，而单味中药常难以达到较满意的治疗效果，因此本课题选用有效果的单味中药黄酮成分进组方，即解决了质量控制问题，也能达到比较满意的治疗效果。5. 研究计划与进展
研究计划
2014.2-2014.3与导师进行交流，确定毕业实习的课题；收集资料，并做好开题报告
2014.3-2014.4 中药成分的准备，运用细胞培养法在鸭胚肝细胞上筛选中药成分的安全浓度，然后筛选出具有抗DHAV感染作用的单味中药成分，获得具有较好抗DHAV作用的中药成分。
