1. 研究目的与意义
一、研究目的
本项目旨在将当归挥发油提取率提高到实验室提油率的50%以上（当归挥发油收率>0.3%），并通过包合工艺等制剂手段使其在制剂中得到有效保留，在此基础上建立当归配方颗粒中挥发油类成分的质量控制方法。
2. 文献综述
当归挥发油成分的化学、制剂和药理研究进展
南京中医药大学 中药151班 房雨彤
摘要本文以1999~2018年的研究文献为基础，从化学成分、制剂工艺和药理学研究3个方面对当归挥发油的相关内容进行归纳总结，阐述了当归挥发油的化学组成及其影响因素，分析了β-环糊精包合工艺的优化条件，比较了不同剂型中当归挥发油的组成和含量，总结了当归挥发油对平滑肌、心血管系统等方面的药理作用，为进行当归配方颗粒生产工艺的相关研究提供参考。
关键词当归；挥发油；藁本内酯；包合；配方颗粒
当归为伞形科植物当归Angelica sinensis(Oliv.) Diels的干燥根。主产甘肃东南部，以岷县产量多，质量好。其味甘、辛，性温；具有补血活血，调经止痛，润肠通便的功效。用于血虚萎黄，眩晕心悸，月经不调，经闭痛经，虚寒腹痛，风湿痹痛，跌扑损伤，痈疽疮疡，肠燥便秘[1]。当归中含有香豆素、挥发油、有机酸、多糖等多种成分，挥发油是当归药效的重要来源，其中藁本内酯的含量最高，其次为丁烯基酞内酯。当归挥发油具有改善血液流变性、抗血栓、抗炎、抗肿瘤等作用，并且对子宫平滑肌的双向调节作用，在临床上运用广泛。
1. 当归挥发油化学成分研究进展
1.1 当归挥发油的化学组成
中草药中的挥发性成分通常采用蒸馏法（共水蒸馏或水蒸气蒸馏法）提取，并用气相色谱-质谱（GC-MS）联用法检测分析[2]。丁军霞等[3]采用水蒸气蒸馏法提取当归挥发油，结合GC-MS质谱库检索和保留指数两种方法，共鉴定出35种化合物，化学成分的结构以长链烷烃及烯烃、单萜、倍半萜烯类等为主，还有一些芳香醛、倍半萜醇类成分。周围等[4]采用水蒸汽蒸馏法结合GC-MS检测，得到30种成分中，藁本内酯的含量达到80%以上，3-正丁烯基苯酞、α-蒎烯、β-罗勒烯的含量均超过1.0%，说明挥发性成分主要为藁本内酯。藁本内酯在化学结构上属于苯酞类化合物，有Z-藁本内酯（Z-ligustilide）和E-藁本内酯（E-ligustilide）2种异构体（见图1）。藁本内酯极性小，易溶于乙醇、乙醚、乙酸乙酯、甲醇等有机溶剂，具有易挥发，稳定性差，易受温度、光照等影响而发生降解的特点[5]。
1.2 当归挥发油成分的影响因素
不同的产地、栽培方法、炮制方法和贮藏条件对当归挥发油的化学组成和含量均有一定的影响。王洮惠等[6]发现甘肃岷县当归挥发油提取率为0.5%；甘肃渭源当归挥发油得率为0.4%，四川药市当归挥发油得率为0.3%，说明岷县当归质量最佳，因而素有中华当归甲天下，岷县当归甲中华的美誉。丁军霞等[3]以7个产地的44批当归药材为研究对象，通过相度分析和聚类分析发现各产地当归挥发油具有较大的差异，说明环境因素（海拔、气候、土壤等）对当归挥发油的组成与含量产生影响。高云涛等[7]发现，生当归挥发油平均含量（0.5%）低于酒当归挥发油平均含量（0.55%），而土炒当归挥发油平均含量最低（0.4%）。宋金春等[8]以生当归、酒当归、当归炭为研究对象，发现藁本内酯在当归炭中含量最高，在生当归中含量最低。
研究表明[9]，当归挥发油的主要成分Z-藁本内酯中含有不饱和苯酞结构和活泼的丁烯基，极易发生多种异构化或降解反应。放置于光照条件下，Z-藁本内酯将生成邻苯二甲酸酐、正丁烯基苯酞、3，d-环氧藁本内酯等多种异构化化合物[10]。Fang Xin等[11]用90%的甲醇溶解藁本内酯，在室温下放置1月后，用色谱方法检测得到了14个藁本内酯的转化产物，并通过电喷雾电离质谱(ESI-MS) 、核磁共振(NMR) 等光谱分析法以及利用液质联用(LC-MS)峰面积归一化法确定了其结构及其转化产物的相对含量，结果表明藁本内酯的主要转化产物为其二聚体。赵一等[12]研究发现Z-藁本内酯的异构化与其在提取物中的相对含量、保存状态、温度以及稳定剂有关，随着提取物中Z-藁本内酯相对含量的不断提高，异构化的速率会加快；Z-藁本内酯在高温下可发生脱氢、降解等多种异构化反应，故低温有利于Z-藁本内酯的保存；若将Z-藁本内酯均匀地分散于稳定剂油酸乙酯和表面活性剂吐温-80中时，可减少当归挥发油的挥发性，增加其理化稳定性。
1.3 当归挥发油的提取方法
当归挥发油的提取方法有水蒸汽蒸馏法、有机溶剂提取法（如石油醚、氯仿-正已烷混合溶剂索氏提取法）、超临界CO2萃取法、超声波提取、微波提取、固相萃取法（SPE萃取）等。其中水蒸气蒸馏法是一种历史悠久的经典提取方法，广泛应用在中药挥发油的提取中。已有的研究表明，水蒸气蒸馏法需要把控的条件为蒸馏时间、液料比例、提取时间。杨荣平等[13]在提取过程中发现，蒸馏时间与粉碎度对提取率有显著影响，浸泡时间越长，提取率越高；粉碎度对提取率的影响则是先升高后下降，得出最优提取工艺为当归粉碎度10目，加水量10倍，浸泡3h，提取8h，提取率为0.5%。此外，挥发油的溶解度对其提取率也有显著影响。李桂生等[14]将水蒸气蒸馏法和超临界流体萃取法进行综合比较，发现两者的成分及Z-藁本内酯的含量基本一致,而超临界CO2萃取所得当归油的收率约为水蒸气蒸馏收率的2倍；易延逵等[15]在探究当归提取成分种类与提取工艺相关时发现，以超临界CO2萃取所得当归挥发油中所含的化学成分种类最多，而且藁本内酯的相对含量最高，说明超临界CO2萃取法是提取当归挥发油相对较好的方法。
在现代化大生产中，常采用多功能提取罐（见图2）提取中药中的挥发油成分。邬文力等[16]发现，影响提取挥发油量及质量最主要的因素为加热程度。从理论上看,加热量越大,产生的蒸汽量越多,提取速度越快。但生产上必须考虑设备的冷凝能力,若蒸汽量越大,冷凝能力不足,则导致挥发油挥发散失及乳化。就工作设备而言,夹层蒸汽压力大于0.1MPa以上,则出现冷凝能力不足,蒸馏液过热,挥发成分挥发散失及乳化。药材细度、加水量也会影响提油效率。此外，在提取过程中还需注意油加热至煮沸前,应采用直接蒸汽加热,这样可以加快煮沸的速度,加热至将近沸腾(80℃~90℃)时,即转用夹套加热,若继续采用直接蒸汽加热,则会蒸出饱和芳香水而得不到挥发油,且易使罐内带有小药渣的药液冲上管道,污染蒸馏液。
图2 多功能提取罐[17]
2. 当归挥发油制剂工艺研究进展
2.1 当归挥发油的包合工艺
挥发油性质不稳定，与空气、光线经常接触会逐渐氧化变质，失去原有的气味，形成树脂样物质，不能随水蒸气蒸馏。在贮存和制剂的过程中，为避免挥发油成分被破坏或损耗，常采用环糊精包合技术制成包合物。β-CD（β-环糊精）不仅水溶度高 (75g/100mL)，对热稳定，而且对肾、肌肉和黏膜几乎无刺激，被人们认为是一种低毒、安全、有效、具有广阔前景的水溶性包合材料，可与多种客体药物包结，能使客体药物的稳定性提高，并可增加药物的溶解度[18]。具有独特的当归香气和苦味的当归经β-CD包合后，由油状液态变为固态，掩盖气味，避免了挥发，增加其有效成分的稳定性，又因β-CD立体结构外部有很多亲水性醇羟基，可增大挥发油在水中的溶解度和溶解速率，从而可提高其生物利用度，为制备中成药的各种制剂特别是片剂、颗粒剂等固体剂型创造了先决条件[19]。
挥发油的包合方法主要有研磨法、饱和水溶液法和超声法。罗玉川等[20]采用正交实验法，对饱和水溶液法包合当归挥发油进行条件优化，结果表明β-CD与被包合物最恰当的比例为1:1(摩尔比)，包合温度在40℃~80℃之间,包合结果无显著区别。由于β-CD的溶解度随温度的增高而增大，为提高产品质量，应采用高温包合(80℃)。李元波等[21]对研磨、饱和水溶液、超声三种包合工艺进行条件优化，以饱和率、收得率、含油率为评价指标，综合比较发现研磨法的包合率较低，其主要取决于研磨时所加溶剂是否适量、挥发油溶液是否呈分子分散；饱和水溶液法有一部分挥发油分散在水中，包合率很低，同时β-CD在水中有一定的溶解度，造成包合物的收得率也很低；超声法包合时间短，操作简便，条件易于控制，包合效果好，但容易受到仪器条件的限制。
2.2 当归挥发油相关剂型的质量研究
目前已有当归汤剂、配方颗粒、口服液、浓缩当归丸、当归复方微乳、复方当归注射液等多种剂型，与传统汤剂相比，多种新剂型具有保存和服用方便、起效迅速、气味口感更佳等优势，但在制备过程中可能会造成有效成分的损耗，因此要确保其质量必须要对有效成分进行测定分析。韩继红等[22]通过HPLC特征图谱比较，分析当归补血汤剂、配方颗粒、口服液3种不同制剂中特征峰、主要成分和未知成分的差异，发现配方颗粒和口服液色谱峰的数目和面积均有不同程度减少，各种成分比例具有较大差异。与汤剂相比，当归补血配方颗和口服液在制剂过程当中，化学成分受到不同程度的损失，可能影响其临床疗效。王振忠等[23]通过HPLC-DAD-ESI-MS联用技术建立了当归药材的标准指纹图谱，将浓缩当归丸的指纹图谱进行共有峰比较分析，发现浓缩当归丸的指纹图谱与当归药材指纹图谱具有相似性，说明浓缩当归丸性质较稳定。孙阳阳等[24]通过液相色谱法，以linertsilOSD-3为色谱柱，C18为保护柱，乙腈-水(55：45)为流动相，测定了复方当归微乳中藁本内酯的含量，得到平均每克微乳含15.440mg藁本内酯，RSD为1.399%，表明当归挥发油主要有效成分藁本内酯在微乳制剂制备过程中不易散失，性质稳定。冯丽莉等[25]以藁本内酯为对照品溶液，不同批次的复方当归注射液为样品溶液，在相同的条件下测定指纹图谱，样品指纹图谱中的最高峰的保留时间与藁本内酯的保留时间一致，说明复方当归注射液工艺合理，质量稳定。
3. 当归挥发油药理作用研究进展
3.1 调节子宫平滑肌
当归中的藁本内酯具有抗乙酰胆碱的作用，能抑制子宫平滑肌收缩。朱洁等[26]通过统计藁本内酯对大、小鼠子宫及卵巢系数的研究,说明藁本内酯会对生殖系统产生一定的抑制作用。王小荣等[27]通过测定痛经模型小鼠子宫重量、子宫组织中NO和Ca2 水平研究当归油对子宫的作用，发现当归油可升高痛经模型小鼠子宫组织中NO的含量，同时降低Ca2 水平，由此推测其抑制子宫平滑机收缩的作用机理可能与影响子宫组织中NO和Ca2 的水平有关。近年来，有研究表明藁本内酯对动物子宫平滑肌呈双向调节作，肖军花等[28]采用离体子宫肌张力记录法对当归挥发油进行了研究,结果发现当归挥发油对正常离体大鼠子宫的收缩功能，小剂量(≤20mg/L)略有兴奋作用,大剂量(≥160mg/L)则呈明显抑制作用，较大剂量当归挥发油可浓度依赖性地抑制缩宫素诱发的子宫兴奋作用，也可明显抑制高钾引起的子宫收缩。
3.2 改善血液流变性和抗血栓
现代药理研究表明，当归可治疗心、脑血管疾病，如冠心病、高血压、高血脂、血栓闭塞性脉管炎等。研究显示[29]，藁本内酯可以剂量相关性地减轻模型大鼠动脉血栓的重量和减少腺苷二磷酸所致血小板聚集，说明藁本内酯可能通过抗血栓及抗血小板聚集而发挥抗动脉粥样硬化作用。刘骏等[30]采用藁本内酯3个剂量组(3.0、1.5、0.75mg/kg) 干预急性家兔微循环障碍模型，发现均能明显改善血液流态，使血流流速增加，改善红细胞聚集状态，降低微血管通透性，减少微血管渗漏；同时观察到藁本内酯显著降低内毒素休克小鼠的死亡率，有效改善内毒素大剂量所致的微循环障碍，因此藁本内酯还可用于治疗和预防与微循环有关的障碍。
3.3 抗炎和抗肿瘤
当归挥发油对多种致炎剂引起的炎症均有抑制作用，研究表明[31]，2.5~10mg/kg剂量的藁本内酯在初期和晚期均能明显减少醋酸所致扭体次数和福尔马林所致添足时间，说明藁本内酯对急、慢性疼痛均有抑制作用。陈永红等[32]研究表明，藁本内酯可通过抑制星形胶质细胞中的核因子-κB(NF-κB)化来抑制脂多糖（LPS）诱导的促炎症相关的细胞因子的表达。此外，当归挥发油还具有抗肿瘤作用。胡碧薇等[5]的研究指出，藁本内酯可能通过干扰细胞的生长周期而抑制肿瘤细胞的生长。相关报道[33]证实藁本内酯对肠癌细胞HT-29抑制作用要强于对正常结肠细胞CCD-18Co细胞毒作用，说明藁本内酯主要是通过抑制细胞增殖而非细胞毒素实现的抗癌作用。
4 小结
当归为妇科调经要药，疗效显著，临床用药历史悠久，市场前景广阔。随着科学技术的不断发展、科研水平的不断提高，当归挥发油中的药效成分、药理作用机制越来越被人们清晰地认识。虽然许多实验研究已经分析总结出当归挥发油相对最优的提取方法、分析手段、包合和制剂工艺，但实验室与企业大生产的条件、环境存在较大差异，在实际生产中，必须综合考虑运行成本、设备状况、生产效率、安全性等多方面问题，选择最优的工艺和参数。我们要加快推进对当归挥发油生产工艺的研究，利用设备改良、工艺参数优化、辅料选择等手段使当归挥发油成分在适宜的新剂型中得到合理的保留，建立当归挥发油类成分的质量控制方法。这不仅有利于提高企业生产效率，降低成本，增加经济效益，更有助于实现中药标准化，让中医药更加适应现代需求，从而完善中医药产业链的发展，实现中医药在世界范围的推广与弘扬。
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3. 设计方案和技术路线
研究方案
2.1 当归标准汤剂的制备
（1）选取三个当归主产地，各收集5批药材。按药典方法制备15批当归饮片。按下法制备15批当归标准煎液。
4. 工作计划
2022.2.202022.2.28：查阅整理文献资料，设计实验方案，完成开题报告
2022.3.1 2022.3.30：进行当归挥发油的工业化提取研究
2022.4.1 2022.4.30：进行β-环糊精包合工艺研究
5. 难点与创新点
首次对企业大生产提取当归挥发油收不到油的原因进行系统分析，并提出合理解决方案。
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