黄蜀葵脱毒苗快繁体系的初步研究开题报告

1. 研究目的与意义

1.应用细胞的全能型理论，即已经分化的细胞仍具有有发育成完整个体的潜能可以将黄蜀葵嫩茎或子叶或下胚轴组织培养成完整的黄蜀葵的植株。国内研究者在探讨黄蜀葵的组织培养的成因时，发现影响黄蜀葵组织培养的影响因素有基因型，不同产地种子的选择、外植体和培养基的选择、植物生长调节剂、愈伤组织培养。

2.黄蜀葵的基因型是离体培养再生能力的重要因素。对不同产地的黄蜀葵种子，大多数研究者认为选择嫩茎的愈伤组织培养发芽率比较高。

3.在黄蜀葵的愈伤组织诱导和分化中基本培养基成分对胚性愈伤组织的诱导率和质量均有显著影响一般认为MS培养基对体细胞的发育更为有利。

2. 文献综述

蜀葵组织培养的研究进展

药学院2012级 学生：图尔荪古丽 指导老师：张瑜

摘要：对黄蜀葵Abelmoschus manihot(L.)Medic组织培育的发展过程，培养基及激素的种类，外植体的种类，愈伤组织培养、脱毒苗的获得和病毒的检测方式等进行了综述，以期为黄蜀葵组培苗的发展提供理论依据。

关键词:黄蜀葵;组织培养；脱毒苗。

黄蜀葵Abelmoschus manihot(L.)Medic. 系锦葵科秋葵属植物，别名侧金盏、秋葵、黄葵、豹子眼睛花、霸天伞、棉花葵，全草入药。秋季挖根；秋季收种子，晒干；夏秋采收叶和花［1］。具有清热，凉血，解毒功效。种子和根用于大便秘结、小便不利、水肿、尿路结石、乳汁不通等；叶外用治疔疮、腮腺炎、外伤出血等。将黄蜀葵花浸入菜油，外用可治痈疽肿毒、水火烫伤。黄蜀葵不仅可以入药，还可以从茎秆中提炼植物胶作为食品添加剂，在食品工业中可用做增稠剂、稳定剂和乳化剂，它可用于冰淇淋、雪糕、冰棍和面包、饼干、糕点、果酱等食品的制作［1~3］。

黄蜀葵花的繁殖方法主要是种子繁殖。也可用分株和扦插繁殖，分株繁殖宜在春季进行，扦插应选用基部萌蘖作为插穗。在南方多作两年生栽培；北方可露地直播，当年开花。采用组织培养快繁技术不仅能保持品种的优良特性，还可不受外界条件的影响，周年繁殖，在较短时间内，繁育出大批种苗因此，组织培养技术对黄蜀葵的繁殖具有很高的经济价值和广阔的市场前景。

黄蜀葵原产于我国南方，后引入印度等国。黄蜀葵对霜冻非常敏感，因此其在热带及亚热带地区能更好的生长［11］。黄蜀葵( 原变种) 产于河北、山东、河南、陕西、湖北、湖南、四川、贵州、云南、广西、广东和福建等省区，印度、斯里兰卡、北昆士兰等地也有分布，常生于山谷草丛、田边或沟旁灌丛间; 刚毛黄蜀葵( 变种) 产于云南、贵州、四川、湖北、广东、广西及台湾等省区，亦分布于印度、锡金、尼泊尔和菲律宾等地［10-11］。变种刚毛黄蜀葵与原变种的不同处在于植株全体密被黄色长刚毛。

目前，有关黄蜀葵的研究主要集中在药理作用、成分分析与测定、栽培及繁育［11］ 方面，有关黄蜀葵组培苗脱毒的研究尚属空白。本实验旨在通过组织培苗脱毒技术，建立黄蜀葵组织快繁体系，为进一步优良其品种选育工作奠定基础。

植物快速繁殖技术始于20 世纪60 年代，法国的Morel用茎尖培养的方法大量繁殖兰花获得成功，从此揭开了植物快速繁殖技术研究和应用的序幕。目前，通过离体培养获得小植株并且具有快速繁殖潜力的植物已有100 多科1000 种以上，有的已经发展成为工业化生产的商品。世界上80% ～ 85% 的兰花是通过组织培养进行脱毒和快速繁殖的。培养的植物种类也由观赏植物逐渐发展到园艺植物、大田作物、经济植物和药用植物等。在我国，同类的研究始于20 世纪70 年代。马铃薯无毒种薯和甘蔗种苗已在生产上大面积种植，30 余种植物已进行规模化生产或中间试验。利用组织培养进行植物快速繁殖及无病毒种苗生产，不仅能够挽救珍惜濒危物种，而且能够解决植物野生资源缺乏的问题。

1.培养基的种类及成分

培养基是培养物生长分化的基质，一般由水，无机盐（大量元素，微量元素），有机营养成分（糖类，维生素类，氨基酸类，肌醇，有机附加物），植物生长调节剂（生长素类，细胞分裂素类），凝固剂（琼脂）和天然附加物等几类物质组成［7］。

目前对黄蜀葵组培研究用的比较多的培养基是MS为基本培养基,琼脂浓度为0.8%，调pH 值5.7~5.8，蔗糖为3%；激素种类和使用浓度为0．3～0．5 mg／L1AA、0．50～2.00 mg／L6一BA和1.00mg/LNAA.

夏鸿飞等以具有杂种黄蜀葵嫩茎为材料，采用组织培养的方法，进行了嫩茎的愈伤组织诱导、分化，不定芽的生根以及试管苗的生根继代增殖培养、移栽与定植的研究。 结果:嫩茎愈伤组织诱导培养和继代增殖培养的理想培养基是MS＋6-BA0.75ｍｇ／L＋2,4－D2.1ｍｇ／L ；愈伤组织分化培养的理想培养基是MS＋AgNO31.0ｍｇ／L＋NAA0.1ｍｇ／L＋ZT1.6ｍｇ／L ；1/3MS＋蔗糖10g/L＋IAA0.4ｍｇ/L是不定芽生根培养的理想培养基；试管苗生根继代增殖培养的理想培养基是1/3MS＋ABT0.6ｍｇ/L＋蔗糖10ｇ/L＋IAA0.4ｍｇ/L．试管苗移栽成活率为93.9%，定植成活率为97.5%定植的试管苗保持了杂种黄秋葵所有植物学性状和杂种优势［2］。

卢伟宝等采用蜀葵无菌苗的茎段作为外植体对蜀葵进行离体快速繁殖，茎段接种4~5周至接诱导出不定芽，芽诱导培养基MS 6-BA1mg/L为最佳；增值培养以MS 6-BA2mg/L NAA1mg/L为好。其增殖系数高，幼苗生长快而健壮；而根的诱导则以1/2MS 蔗糖浓度10g/L相对理想［6］。

朱云华等以黄蜀葵子叶和下胚轴为外植体进行组织培养，寻找适宜诱导黄蜀葵子叶和下胚轴愈伤组织发生和分化的激素配比。方法 :采用不同激素配比MS 培养基对黄蜀葵子叶和下胚轴分别培养。 结果: 适宜下胚轴愈伤组织诱导的培养基为MS IAA0.5 mg/L KT1.0 mg/L，MS IAA0.7 mg/L KT1.0 mg/L 可诱导愈伤组织产生丛生芽，同时还可诱导下胚轴直接产生幼苗。适宜生根培养基为1/2MS NAA0.1 mg/L，植株粗壮，主根少，须根多［5］。

MS (Marashige一skoog)培养基, 原来是为培养烟草细胞设计的。目前它应用的范围较广泛, 如在固体培养条件下培养愈伤组织; 在液体培养条件下作细胞悬浮培养; 还用在形态发生的研究方面, 都得到好的结果。这种培养基中无机营养物的数量和比例都较合适, 足以满足很多培养细胞在营养和生理上的要求, 在一般情况下不必加氨基酸、水解干酪素、酵母提取物或椰乳等类有机附加物。M s 培养基中硝酸盐、钾和铵盐的含量比其它培养基高, 这是它的明显特点［9］。

White培养基1943年是为培养番茄根尖而设计的。1963年又作了改良，称作White改良培养基，提高了MgSO4的浓度并增加了硼素。其特点是无机盐含量较低，适于生根培养［7］。

B５培养基原来是为了培养大豆组织而设计的。培养基的主要特点是铵盐的含量较低, 因为铵盐对不少培养物来说有抑制其生长的作用。有人用B5与MS 作过比较培养实验, 发现有些植物的愈伤组织和细胞培养物在MS 中长得比在B5中好一些,有的植物则相反。应用表明，有些植物在B5培养基上培养更为适宜，如双子叶植物，特别是木本植物［9］。

SH ( schenkhid和Hidebrandt )培养基与B5相类似,不用(NH4)2SO4，而改用NH4H2PO4,无机盐的浓度较高，在不少单子叶赫双子叶植物上使用，效果很好［9］。

HE (Heller) 培养基在欧洲得到广泛应用。钾盐和硝酸盐是通过不同的化合物来提供的，含大量元素，维生素，不含蔗糖，琼脂［7］。

N６培养基是中国科学院植物研究所的科研人员自行设计的, 在国内已经广泛用在花药和花粉的培养上。这种培养基适用于禾谷类植物花药和花粉的培养。其成分与B5相似, 但也不含铂盐［9］。

讨论不同培养基的相似性, 主要是比较它们的矿质盐的成分, 因为培养基中维生素、激素和其它附加物是随着不同种的植物和不同的研究目的而异的。过去曾经报道过不少新的培养基, 往往认为由于加入了有机附加物, 满足了细胞对氮和其它营养物的需要, 适宜细胞的生长。而得到好的结果。但是在很多情况下, 这种需要可以通过增加无机盐的浓度, 特别是提高氮、蔗搪和维生素的浓度而得到同样的效果［9］。

2 接种外植体的种类

2.1胚 朱华云等将黄蜀葵无菌苗下胚轴、子叶接种到MS IAA 0.5 mgL-1 KT 1.0 mgL-1，培养基上 。结果表明，从整体上看，KT IAA 激素组合对黄蜀葵愈伤组织的诱导较好，愈伤组织生长快，颜色浓绿，诱导的愈伤组织块粗大致密。以下胚轴为外植体，不定芽平均诱导率为28％，以子叶为外植体的愈伤组织未诱导出不定芽。下胚轴愈伤组织的平均诱导率及高于子叶，说明下胚轴易诱导产生愈伤组织，其脱分化能力比子叶强。说明下胚轴的再分化能力也高于子叶。

2.2茎段 卢宝伟等等以黄蜀葵无菌苗带节茎段为材料，培养在 2.MS 6-BA2.0mg/L NAA1.0mg/L，组培苗生长速度快，苗生长健壮。

黄蜀葵组织培养常用的培养基组成及用途

3.脱毒苗的获得及检测

3．1 脱毒苗的获得方式

夏鸿飞［2］卢伟宝［6］将嫩茎切成长约1.0cm 的茎段，接种到以MS＋6-B0.75ｍｇ／L NAA1.0mg/L为培养基，进行嫩茎愈伤组织的诱导培养，可以在较短时间内诱导出绿苗，且形成的愈伤组织少，成苗率高，正常条件下培养试管苗脱毒率达到100．O％ ，效果最好。在培养基中加入0．5 mg／L IBA能使组培苗生长健壮，根系发达，移栽成活率高［4］。

3．2 脱毒苗病毒的检测 脱毒处理的黄蜀葵试管苗须经严格检测，证明没有病毒粒体存在后，才能作为脱毒苗。日前脱毒苗的病毒检测方法主要有以下3种［4］。

3．2．1 直接检测法。对脱毒处理得到的黄蜀葵试管苗移栽后与感染仡叶病毒的植株进行植物形态比较，脱毒的种苗应生长健壮、无花叶病毒特有的可见症状。

3．2．2 指示植物法。以黄瓜作为指示植物，脱毒处理的黄蜀葵组培苗隔离土培2个月后，将未出现染病症状的植株的叶片与明显染病植株的日／-片用擦液法接种于黄瓜，一段时间

后观察无病叶接种的黄瓜是否有病毒症状从而鉴定相应植株是否脱毒。

3．2．3 电镜观察病毒和叶片的游离氨基酸检测法。利用电子显微镜直接观察、检查有无病毒颗粒存在以及颗粒大小、形态和结构，借以鉴定病毒种类。以上3种黄蜀葵病毒的检测方法都存在一定的不足：直接检测法和指示植物法操作方便简单，但不能做到快速检测，且灵敏度有限，可信度不高。对无毒苗和有毒苗叶片的游离氨基酸进行检测，林治良等的研究结果表明，无毒苗和有毒苗的游离氨基酸的含量差异达到显著水平［4］ 。

3.2.4 取高温脱毒培养后植株的幼叶1～3g，在研钵中加少量水和等量磷酸缓冲溶液(pH 7．0)后研磨成匀浆，取少量浆液涂抹在健康西红柿植株的叶片上并涂上少量石英沙颗粒作磨擦剂进行接种．5rain后用清水冲洗叶面。然后将西红柿植株置于温室隔离网内进行培养，4～6周后，检查西红柿叶片上是否产生病斑。

3.2.5 待组培瓶苗长至2～4 cm高时，切取叶片提取RNA或DNA，利用PCR法检测病毒。

近些年发展的酶联免疫法(ELISA)及RTPCR等病毒检测方法具有灵敏、快速和特异性强等优点，在脱毒苗检测中应用较多。但目前在黄蜀葵脱毒苗中的应用尚属空白。我们可以利用罗汉果的脱毒苗检测方法来检测黄蜀葵组培苗。

4.黄蜀葵脱毒苗快繁过程中的异常症状及分析

4．1污染的原因及防治措施

4．1．1 污染的原因 脱毒苗在培养过程中会发生污染的现象，主要原因有：种子带菌，苗床带菌，土壤里的细菌，材料灭菌不彻底；培养基灭菌和接种工具灭菌不彻底；操作人员带入杂菌；周围环境不清洁，超净工作台的过滤装置失效，培养瓶瓶口过大。

4．1．2 防治措施 为了防止脱毒苗的污染，主要采取以下措施：种子要消毒，每个环节都得注意灭菌保持室内环境的清洁；做好接种材料的室外采集工作；对外植体进行严格的灭菌；对培养基和接种工具进行彻底灭菌；在接种时一定要严格按照无菌操作规程进行，防止交叉污染。

5.小结

从这几年的研究结果来看,对黄蜀葵的组织培养方面的研究很受欢迎。黄蜀葵组织培养工作开展较迟，目前尚处于初步研究和探索阶段，大多还仅仅局限于不同材料的快繁研究，即研究的重点在于确定组织培养中控制分化、增殖、生根的主要因素。

植物组织培养是指利用细胞全能性培养再生植株的技术,由于其具有快速繁殖、产生脱毒苗、培育新品种、克服杂交不亲和障碍和保存种质资源等应用优点。黄蜀葵一般是种子繁殖,而且适应性比较强,但是生长到某个点的时候病虫害比较严重,而且产量很低，黄蜀葵也可以分株和扦插，但是很难培养出性状美观，具有优良特性的，具有较高有效成分的植株，所组织培养是具有较高的研究价值。组织培养技术需要考虑很多方面因素比如组织培养方法的选择，外植体的选择，培养基的选择，激素的选择。培养基的配制方法比较繁琐，需要进一步探索。

黄蜀葵组组培苗的脱毒技术尚属空白，本实验是利用黄蜀葵的茎段的愈伤组织培养来获得脱毒苗，在这过程中也有许多影响因素，还有注重操作过程中的灭菌是很重要的一个过程。目前没有黄蜀葵脱毒苗快繁技术的研究，所以不太确脱毒苗的成功率。。因此，要加强脱毒苗的规范管理和严格的病毒检测，同时还要加强通过基因工程技术将抗病、抗逆等相关基因转到黄蜀葵脱毒苗中，提高它的抗病、抗逆能力，从而提高它的产量。还可以用水培快繁技术来获得无毒植株，这种技术用于紫色马铃薯，也可以借用于黄蜀葵的研究中，也是一种很好的快繁技术，可以不免一些不必要的麻烦还有待进一步研究［13］。

参考文献

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［5］朱华云，谈献和,李建,张媛, 王康才.黄蜀葵的组织培养的初步研究［J］.现代中药研究与实践2010(04)

［6］卢宝伟 ，安凤霞, 唐翠, 王洪军.蜀葵组织培养与快繁体系建立［J］.国土与自然资源研究，2010（01）

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3. 设计方案和技术路线

研究方案：1.实验目的:快速繁殖黄蜀葵的脱毒苗,减少大田发病率,解决黄蜀葵的连作障碍.2.实验内容: 1)种子消毒 取种子50 粒流水冲洗30min，放入75％的酒精消毒10 s，无菌水冲洗1 次，而然后放入0.1％的升汞溶液中5 min，最后用无菌水冲洗5~7 次，放置于灭菌滤纸上吸干水分，进行接种。2)取外植体，外植体消毒 从生长健壮、无病虫害的植株的茎段，用流水冲洗30S以上，然后用70％酒精消毒30 S，再用0．1％升汞消毒6～8 min，最后用无菌水漂洗干净并用灭菌滤纸吸干水分 3)茎段脱毒 取茎段放置在MS培养基上培养。4)病毒检测 待组培瓶苗长至2～4 cm高时，切取叶片提取RNA或DNA，利用PCR法检测病毒瞳 。去除带病毒的幼苗，将无病毒的幼苗继续利用诱导培养基进行培养或扩繁，当幼苗长出3～5条根时进行驯化移栽。5)定植苗床的准备使用元土育苗基质，要求基质理化性质稳定，具有良好的保水保肥能力，透气性好，pH5．5～6．5。多次使用过的基质必须经过灭菌。6)脱毒苗的驯化 从组培室移出的瓶苗在移栽前需要进行锻炼,以适应外部环境 7)定植 将驯化好的幼苗从组培瓶内轻轻倒出轻轻去除幼苗根部粘着的培养基放入清水中将根部附着的培养基清洗干净,然后将幼苗按大小分级,将无根苗单独种植.8)移植后的苗床管理 移苗后为促进缓苗,幼苗的生长环境需要保持高湿度,但高湿度容易滋生病害,为减少病害,应适当通风换气,并逐渐增加通风时间. 9)脱毒苗的繁育 经过在苗床上1~2月的生长,组培苗即可转移到大田中进行子苗的繁育.

技术路线：

4. 工作计划

在做黄蜀葵种子品质检验及质量标准初步研究的实验比如种子净度分析，千粒重，种子水分测定，活力测定以及发芽率和发芽势的记录。取茎段在相应的培养基上培养成愈伤组织。

5. 难点与创新点

关于黄蜀葵的组培苗脱毒方面的研究尚属空白，做脱毒苗快速繁殖，避免了种子带菌和苗床带菌或土壤带菌方面的因素得到优良的植株提供理论依据。

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